馬曉平，孫琪，焦妃，陳思馨，王全年

寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004

◆實驗研究論著◆

逍遙散對抗慢性應激狀態(tài)下大鼠海馬神經(jīng)細胞N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NR）各亞基m RNA表達的影響

馬曉平，孫琪，焦妃，陳思馨，王全年

寧夏醫(yī)科大學中醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004

目的：觀察逍遙散對抗慢性應激狀態(tài)下大鼠海馬神經(jīng)元代細胞內(nèi)N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NR）各亞基mRNA表達的影響。方法：用Taqman熒光定量PCR法測定2-△△Ct相對定量法計算NR各亞基表達量相對值。結果：慢性應激微環(huán)境導致海馬神經(jīng)元代細胞內(nèi)NR的各亞基mRNA表達有不同程度的改變；在擬慢性應激作用前對細胞進行對應血清處理，逍遙散含藥血清使NR2AmRNA表達水平明顯上調(diào)，NR2BmRNA、NR1mRNA表達水平亦上調(diào)，作用明顯但未達到正常水平。結論：逍遙散治療血清能改變NR的各亞基mRNA表達，從而達到保護神經(jīng)元并對抗慢性應激損傷起到一定的作用。

慢性應激；逍遙散；細胞培養(yǎng)；N-甲基-D-天冬氨酸受體（NR）；海馬神經(jīng)元代細胞

與慢性應激相關的疾病與N-甲基-D-天冬氨酸受體（NR）通過谷氨酸（Glu）誘導興奮性毒性有關，海馬是慢性應激損傷的主要腦區(qū)，而損傷的重要機制是NR被過度激活及因此引發(fā)的一系列級聯(lián)反應［1］。分布在海馬的NR主要是NR1/NR2A、NR1/NR2B，本實驗為證實慢性應激和在逍遙散干預下的海馬神經(jīng)元代細胞內(nèi)NR各亞基（NR1、NR2A、NR2B）m RNA表達情況，觀察慢性應激損傷及逍遙散抗慢性應激損傷的某些機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級新生24 h內(nèi)的W istar乳鼠由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供；體質(zhì)量190～230 g的8周齡雄性W istar大鼠27只，用于制備含藥血清，SPF級，由成都達碩動物有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-24。

1.2 儀器及試劑 Suprafuge 22高速冷凍離心機（德國Heraeus公司），BioPhoto-m eter6131分光光度計（德國Eppendorf公司），PRISMR7000熒光定量PCR儀及分析軟件（美國ABI公司），Prim er5.0引物設計軟件。DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27均為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品，2.5%胰蛋白酶、雙抗、D-hankps液均為Genom公司產(chǎn)品，多聚賴氨酸、L-谷氨酰胺均為Sigm a公司產(chǎn)品，Trizol Reagent、Rnase Inhibitor、Super ScriptTMó反轉錄試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，DNase I（RNase Free）、熒光定量PCR試劑為Takara公司產(chǎn)品，其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物及探針 見表1。根據(jù)GenBank提供的基因序列，利用引物設計軟件設計特異性 NR1、NR2A、NR2B、β-actin引物及探針序列，所有引物及探針均由Invitrogen公司合成。

表1 引物及探針

1.4 慢性應激模型血清及逍遙散含藥血清制備

1.4.1 逍遙散水煎劑制備 按柴胡∶當歸∶白芍∶白術∶茯苓∶甘草∶薄荷∶煨姜=2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1比例配方。先將飲片（薄荷除外）以蒸餾水浸泡1 h，后以武火急煎至沸騰，再以文火煎煮1 h，于起鍋前10m in放入薄荷，過濾取汁后以4層紗布過濾；藥渣再加蒸餾水武火急煎至沸騰，再以文火煎煮0.5 h，過濾取汁。兩次藥汁合并，以旋蒸儀將藥物濃縮至含生藥2 g/m L（約相當于60 kg人用藥劑量的10倍），高溫高壓滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 慢性應激動物模型及血清制備 采用Carter等［2］的多相性應激模型并加以改進，應激原包括：足底電擊（電壓30 V，電擊頻率0.1 Hz，每次持續(xù)1 s，共30次）、冰水游泳（4℃左右，5m in）、禁水（24 h）、禁食（24 h）、束縛（4 h），每天不定時隨機安排一種應激刺激，避免相鄰2天出現(xiàn)重復形成規(guī)律性而造成大鼠適應性，連續(xù)21天。電擊箱為自制的可以調(diào)節(jié)電流、電壓并自動控制電擊頻率的裝置；冰水游泳操作時以溫度計測量溫度，以冰塊及室溫下的自來水調(diào)節(jié)并保持溫度；束縛器為自行設計并于廠家訂制的有機不銹鋼器械，實驗時以剛好容納1只大鼠，使其不能進退及轉身為度。實驗動物隨機分為3組：正常對照組（每天每只灌胃生理鹽水2m L，不進行應激刺激）、慢性應激模型組（每天每只灌胃生理鹽水2 m L后，進行應激刺激）、逍遙散治療組（每天每只灌胃逍遙散水煎劑2m L后，進行應激刺激），連續(xù)給藥、刺激21天，于末次給藥1～2 h后麻醉條件下腹主動脈采血。血液以離心半徑8 cm、3 000 r/m in離心，分離血清，每組血清分別混合后于56℃水浴中滅活30m in。置超凈臺內(nèi)，無菌條件下以0.22μm濾器抽濾除菌，按1m L分裝并標記，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Wistar大鼠海馬神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)

1.5.1 分離海馬組織 多聚賴氨酸處理培養(yǎng)板：無菌條件下取配制好的多聚賴氨酸儲備液（1m g/m L）1 m L，用PBS稀釋至10m L，24孔培養(yǎng)板每孔加400μL，使之浸沒孔底面，靜置1～2 h后吸除，用PBS洗3遍，最后一次吸去所有液體，置超凈臺或培養(yǎng)箱中備用。乳鼠全身皮膚消毒：取新生24h內(nèi)的W istar乳鼠數(shù)只，先于準備間內(nèi)用70%～75%酒精棉球擦拭乳鼠全身皮膚，置潔凈培養(yǎng)皿（足夠盛裝所有實驗用乳鼠即可）中，由傳遞窗傳入細胞培養(yǎng)操作室。于超凈臺內(nèi)進行海馬剝離操作前，再次用70%～75%酒精對乳鼠進行全身皮膚徹底消毒。迅速分離乳鼠海馬組織：無菌條件下于超凈臺內(nèi)，用鑷子夾住乳鼠眼眶以固定頭部，用眼科剪從頸后部先橫向剪開，再從開口中部沿頭骨中線縱向將頭皮及顱骨剪至嗅球部，取眼科直鑷分別向外側掀開左右兩側顱骨，暴露大、小腦及嗅球，用顯微鑷先沿大、小腦分界線橫向切斷大、小腦連接，再沿正中矢狀位（左、右半球分界線）縱向切開左、右半球連接（目的是方便掀開大腦皮質(zhì)并暴露海馬回），另取眼科直鑷小心向外側掀開大腦皮質(zhì)表面，即可見清晰豌豆型海馬，左右各一，用顯微鑷小心夾取海馬從邊緣組織分離，即可得到整個海馬。修凈海馬組織：剝離的海馬組織常因操作者的習慣和技術水平差異而不同程度地挾帶殘留腦膜和血管，剃除此類組織有利于下一步消化分離操作及獲得純度較高的海馬神經(jīng)元。將上一步新剝離的海馬迅速投入冰浴的盛有PBS液的平皿中，在解剖顯微鏡下仔細地剃除殘留的腦膜和血管，剃凈的海馬組織移入另一只冰浴的盛有PBS液的平皿中。

1.5.2 消化分離海馬神經(jīng)細胞 終止液為含體積百分數(shù)90%的DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清；種植液為體積分數(shù)86%DMEM/F12培養(yǎng)基、體積分數(shù)10%胎牛血清、體積分數(shù)2%B27、雙抗溶液（青霉素工作濃度100 U/m L、鏈霉素工作濃度0.1m g/m L）、終濃度為2mm ol/L的谷氨酰胺；飼養(yǎng)液為體積分數(shù)96%Neurobasal培養(yǎng)基、體積分數(shù)2% B27、雙抗溶液（青霉素工作濃度100U/m L、鏈霉素工作濃度0.1m g/m L）、終濃度為2mm ol/L的谷氨酰胺，均以0.1m ol/L NaOH調(diào)整pH值至7.2～7.4，0.22μL濾器除菌，4℃保存?zhèn)溆?。無菌條件下對新生24 h內(nèi)的W istar乳鼠進行急性海馬剝離，迅速置預冷的PBS液中清理海馬上殘留的腦膜及血管，適當剪碎后加等體積的PBS液和2.5%胰蛋白酶消化液，輕輕吹打40～60次，靜置片刻，取上清（部分細胞懸液）至另一潔凈試管中，終止消化該部分細胞懸液。剩余組織再次加入適量等體積的PBS液和2.5%胰蛋白酶消化液，繼續(xù)重復上述吹打消化過程數(shù)遍，直至海馬組織基本消化完全，剩余極少量碎片可棄去。收集全部終止消化的細胞懸液，以離心半徑8 cm、1500 r/m in離心5m in，棄上清，收集海馬細胞沉淀，以種植液清洗2次，再加適量種植液重懸細胞，倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)，將分離獲得的海馬神經(jīng)細胞以5×106/m L密度種植于用多聚賴氨酸（PLL）預先處理過的24孔板內(nèi)，每孔1m L，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后全量換成無血清飼養(yǎng)液，以后每3天進行半量換液。

1.6 神經(jīng)元鑒定實驗 在細胞培養(yǎng)到一定階段，需要對培養(yǎng)物進行鑒定，以確定所培養(yǎng)的細胞是否為實驗所需以及其純度如何。一般神經(jīng)元在培養(yǎng)第7～14天時狀態(tài)最佳［3］，因此本實驗選擇在海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)到第8天時進行鑒定，采用神經(jīng)元微管相關蛋白-2（Map-2）細胞免疫熒光染色法。將培養(yǎng)第8天的細胞取至實驗操作臺，吸去培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗2遍，加入4%多聚甲醛固定30m in；棄去多聚甲醛，用PBS輕輕漂洗3遍，每次10m in。也可適當增多漂洗次數(shù)而縮短漂洗時間，以充分洗去殘留多聚甲醛；用10%山羊血清封閉30m in，棄去不洗；直接加入小鼠抗M ap-2，4℃濕盒過夜；第2天取出培養(yǎng)板（或皿），PBS輕輕漂洗3次，每次10m in；加入二抗（CY3標記羊抗小鼠IgG）；避光用PBS漂洗3次，每次10 m in；避光加入稀釋好的DAPI，2 m in后用PBS漂洗2～3次，盡量在短時間內(nèi)完成漂洗；熒光顯微鏡下觀察，拍照，進行計數(shù)。CY3在554 nm激化，568～574 nm發(fā)射熒光，呈鮮艷紅色，本實驗中該標記物顯示的是神經(jīng)元胞體及樹突；DAPI與DNA結合后在364 nm激化，454 nm發(fā)射藍色熒光，本實驗中標記所有細胞核，代表細胞總數(shù)。根據(jù)公式可計算出神經(jīng)元純度：［Map-2陽性細胞數(shù)/細胞核數(shù)（總細胞數(shù)）］×100%=神經(jīng)元陽性率（即神經(jīng)元純度）。

1.7 對細胞進行分組處理 細胞培養(yǎng)至第8天，進行分組：實驗分為空白對照組、正常血清組、模型血清組和逍遙散治療血清組4組?？瞻讓φ战M為正常培養(yǎng)細胞，不加藥物和血清。操作：吸去原培養(yǎng)液，用PBS液輕輕蕩洗2次，加正常培養(yǎng)液1m L（無血清培養(yǎng)液）；正常血清組均加入正常對照組大鼠血清（用培養(yǎng)液稀釋，終濃度為體積分數(shù)10%）；模型血清組加入慢性應激模型組大鼠血清（用培養(yǎng)液稀釋，終濃度為體積分數(shù)10%）；逍遙散治療血清組加入逍遙散治療組血清（用培養(yǎng)液稀釋，終濃度為體積分數(shù)10%）。作用30m in之后進行RNA提取及PCR檢測。

1.8 熒光定量PCR（Taqman探針法）檢測各組NR1mRNA、NR2AmRNA、NR2BmRNA表達 用 Trizol法提取各組總RNA，Dnase I（Rnase Free）去除基因組DNA，采用紫外分光光度計測定總RNA濃度和純度，分別測定230、260、280 nm處吸光度（OD）值，并計算其比值，所測定的定值為空白對照組585.5 nm、正常血清組409 nm、模型血清組360 nm、逍遙散治療血清組為615.5 nm。每組取RNA2μg進行逆轉錄反應（合成cDNA），按說明書操作步驟進行。每組的每種基因均按照3倍平行孔實驗，50μL體系分別擴增NR1 m RNA、NR2Am RNA、NR2Bm RNA。體系內(nèi)含cDNA模板1μL，熒光定量PCRMasterM IX 25μL，25μm ol/L上、下游引物分別取1μL，25 pm ol/LTaqm an熒光探針12.5μL，ddH2O 8.5μL，95℃預變性2m in，95℃變性1 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40個循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用2-ΔΔCt相對定量法計算各組NR1m RNA、NR2Am RNA、NR2Bm RNA 表達相對量，每組△Ct值以±s）表示。采用SPSS13.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-w ayANOVA），方差齊時采用多組間兩兩比較的SNK檢驗法檢驗，方差不齊時采用Dunnet-tt3檢驗法。

2 實驗結果

各組NR各亞基m RNA表達相對量比較，NR1m RNA逍遙散治療血清組結果接近于正常血清組，正常血清組稍高于空白對照組，模型血清組表達相比更低一些，逍遙散治療血清組比模型血清組高?？瞻讓φ战MNR2Am RNA表達比正常血清組高，模型血清組刺激NR2Am RNA表達較正常血清組作用要高很多；逍遙散治療血清組明顯上調(diào)NR2Am RNA表達。正常血清組對NR2Bm RNA與空白對照組相比具有明顯的下調(diào)，而模型血清組對其影響也有明顯的下調(diào)，但沒有正常血清組的明顯，逍遙散治療血清組下調(diào)，但相對正常血清組與比模型血清組稍高。

表2 各組NR各亞基mRNA表達相對量比較（n=12）

3 討論

海馬是NR含量最高的腦區(qū)之一，若NR因某些原因過度激活，會出現(xiàn)興奮性毒性腦損害，故海馬最容易被興奮性神經(jīng)毒的侵害。本實驗結果表明，以血清模擬的慢性應激微環(huán)境對NR各亞基的m RNA調(diào)節(jié)表現(xiàn)有不同程度的改變，尤其是NR2Am RNA調(diào)節(jié)升高最為明顯。模型血清組NR2Am RNA表達顯著，可能與興奮性神經(jīng)毒作用增強關系密切。逍遙散治療血清組在減輕神經(jīng)興奮性毒性的同時也可能通過某些信號通路啟動神經(jīng)元保護機制，最終起到抗應激損傷作用。逍遙散治療血清組對NR1m RNA表達改善很明顯，可對維持海馬神經(jīng)細胞的穩(wěn)定起到一定作用［4］。該結論與課題組前期在體實驗研究結論取得一致：逍遙散可以顯著下調(diào)慢性應激大鼠海馬神經(jīng)元細胞中的NR各亞基的表達，起到緩減諸應激癥狀的療效［5］。

［1］Suzuki Y， Takagi Y， Nakam ura R， et al.Ability of NMDA and non-NMDA receptor antagonists to inhibit cerebral ischem ia dam age in aged rats［J］.Brain Res，2003，964（1）：116.

［2］ Carter WR， Herm an J， Stokes K.Prom otion of diabetes onset by stress in BB rat［J］.Diabetologia，1987，30：674.

［3］梁傳棟，趙文清，李文玲，等.新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的體外原代培養(yǎng)及鑒定［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2008，33（7）：90.

［4］孫琪，敖海清，富文俊.逍遙散抗慢性應激損傷中樞Glu-NR-Ca2+-GR信號通路機制探討［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（6）：627-632.

［5］富文俊.逍遙散對慢性應激損傷大鼠HPA軸負反饋功能及GR、NR亞型調(diào)節(jié)機制的研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學博士畢業(yè)論文，2009：62.

（責任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2015）06-0265-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.125

2015-01-02

寧夏醫(yī)科大學科學研究基金資助項目（XT2011014）；寧夏自然科學基金項目（NZ11129）

馬曉平（1985-），男，2012級在讀研究生。

孫琪，E-mail：753384458@qq.com。