張臻，闕華發(fā)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所，上海 200032

益氣化瘀法中藥對(duì)糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面TGF-β/ALK 5/Smad2/3通路的影響

張臻，闕華發(fā)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所，上海 200032

目的：探討益氣化瘀法中藥對(duì)糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/激活素受體樣激酶（ALK）5/ Smad蛋白2/3通路的影響。方法：將50只大鼠隨機(jī)分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組、糖尿病對(duì)照組、正常對(duì)照組。通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全層皮膚缺損模型，運(yùn)用Westernblot技術(shù)手段分別檢測(cè)各組肉芽增生期創(chuàng)面成纖維細(xì)胞ALK5/Smad2/3的表達(dá)水平。結(jié)果：糖尿病對(duì)照組ALK5表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組ALK5表達(dá)水平明顯低于糖尿病對(duì)照組（P＜0.05），其與益氣組、化瘀組、正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。糖尿病對(duì)照組smad2表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組smad2表達(dá)水平與各組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。糖尿病對(duì)照組smad3表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組smad3表達(dá)水平低于化瘀組（P＜0.05），明顯低于糖尿病對(duì)照組、益氣組（P＜0.01），高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論：糖尿病創(chuàng)面難以愈合及瘢痕形成的機(jī)制可能與ALK5/Smad2/3通路有關(guān)，益氣化瘀中藥可能通過(guò)抑制ALK5/Smad2/3通路，加速創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。

糖尿病；潰瘍；益氣化瘀法；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/激活素受體樣激酶（ALK）5/Smad蛋白2/3通路

筆者在應(yīng)用益氣化瘀中藥治療糖尿病潰瘍?nèi)〉蔑@著臨床療效的基礎(chǔ)上［1］，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究已初步證實(shí)，創(chuàng)面轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）1的低表達(dá)可能是糖尿病潰瘍難以愈合的原因之一，益氣化瘀法可以通過(guò)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平，同時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）的表達(dá)，并下調(diào)sm ad3、sm ad4的表達(dá)水平，從而提高創(chuàng)面愈合的速度和質(zhì)量［2～5］。為進(jìn)一步深入探討益氣化瘀法促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制，本文研究了其對(duì)糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面成纖維細(xì)胞TGF-β/激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALK）/Sm ad通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁、地龍組成，劑量比例2.5∶2.5∶1∶1，人鼠等效劑量為11.61 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥2.5 g/m L。拆方益氣方由生黃芪、太子參等組成，人鼠等效劑量為6.75 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥1.5 g/m L。拆方化瘀方由桃仁，地龍等組成，人鼠等效劑量為4.86 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥1 g/m L［3］。均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備成煎劑濃縮，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。ALK5一抗，Abcam公司產(chǎn)品（Ab155258）；Sm ad2一抗，Abcam公司產(chǎn)品（Ab33875）；Sm ad3一抗，Abcam公司產(chǎn)品（Ab40854）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司產(chǎn)品（ZB-2301）。

1.2 儀器 RM 2145切片機(jī)，Leica公司產(chǎn)品；IMS細(xì)胞圖像分析儀，上海申騰信息技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MV-CP410攝像機(jī)，Panasonic公司產(chǎn)品；BH2顯微鏡，O lym pus公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組及處理 3月齡雄性SPF級(jí)W istar大鼠，體重200～250 g，平均體重（224.13±13.77）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供［許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2012-0002］。將50只大鼠隨機(jī)取10只為正常對(duì)照組，其余40只大鼠復(fù)制糖尿病性模型，隨機(jī)取10只為糖尿病對(duì)照組，其余30只隨機(jī)分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組。糖尿病性模型鼠實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，定量飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日稱體重，尾靜脈采血和收集尿液，用血糖儀和試紙法分別測(cè)定基礎(chǔ)血糖和尿糖，然后以pH4.6、0.1mm ol/L的枸櫞酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素（STZ），配成1%溶液，以60 m g/kg體重單次腹腔內(nèi)注射STZ溶液，48 h后動(dòng)物血糖濃度＞16.65 mmol/L及尿糖為++++時(shí)，即成糖尿病鼠模型［6］。將所有大鼠麻醉后背部備皮，作直徑10 mm的圓形標(biāo)記，在無(wú)菌條件下，用外科方法切除標(biāo)記處全層皮膚，止血后用無(wú)菌紗布覆蓋，糖尿病性模型鼠即成糖尿病潰瘍模型。造模后每只大鼠連續(xù)4天后腿肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位。各組于創(chuàng)面造模后次日開(kāi)始給藥，換藥前均以1/5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面，外敷單層生理鹽水紗布；正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組生理鹽水灌胃，每天1次；各用藥組，藥物灌胃，每天1次。10天后將大鼠麻醉處死，用眼科手術(shù)剪剪取全層肉芽組織，觀察各組組織病理學(xué)，并以植快培養(yǎng)法進(jìn)行成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，Westernblot法檢測(cè) ALK5、sm ad2、sm ad3各指標(biāo)水平變化。

1.4 Westernblot法檢測(cè) 每組隨機(jī)抽取8個(gè)標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)樣本，各樣品取25μg上樣，m arker取10μL上樣（上樣前按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行預(yù)處理），將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，進(jìn)行電泳。然后轉(zhuǎn)移至PVDF上，用5%脫脂奶粉封閉，分別與特異性的抗體進(jìn)行孵育（稀釋濃度分別為ALK5，1∶500；sm ad2，1∶1000；sm ad3，1∶5000；GAPDH，1∶1500），充分洗滌后孵育HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，掃描分析，測(cè)定蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析比較各組間ALK5、sm ad2、smad3表達(dá)水平的差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組ALK5、Sm ad2、Sm ad3比較，見(jiàn)表1。糖尿病對(duì)照組ALK5表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組ALK5表達(dá)水平明顯低于糖尿病對(duì)照組（P＜0.05），其與益氣組、化瘀組、正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。糖尿病對(duì)照組sm ad2表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組sm ad2表達(dá)水平與各組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。糖尿病對(duì)照組sm ad3表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；益氣化瘀組sm ad3表達(dá)水平低于化瘀組（P＜0.05），明顯低于糖尿病對(duì)照組、益氣組（P＜0.01），高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 各組ALK5、Smad2、Smad3比較±s）

表1 各組ALK5、Smad2、Smad3比較±s）

與正常對(duì)照組比較，①P＜0.05；與糖尿病對(duì)照組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與化瘀組比較，④P＜0.05；與益氣組比較，⑤P＜0.01

組別益氣化瘀組益氣組化瘀組糖尿病對(duì)照組正常對(duì)照組n 8 8 8 8 8 ALK5 4215.59±1194.82②5205.97±1327.38 4878.53±1239.51 6720.21±2137.36①3210.52±767.67 Smad2 2351.63±629.05 2597.17±997.99 2611.01±1201.05 3384.09±1609.57①2056.53±195.06 Smad3 4283.12±1286.48①③④⑤6222.98±1270.56 6037.45±1663.62 8478.76±2147.60①1203.67±772.35

3 討論

糖尿病潰瘍屬中醫(yī)學(xué)潰瘍、消渴等范疇。自20世紀(jì)60年代起，在傳承全國(guó)中醫(yī)外科大家顧伯華先生經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，筆者從中醫(yī)理論、文獻(xiàn)、臨床和基礎(chǔ)研究等方面，對(duì)中醫(yī)藥治療糖尿病潰瘍進(jìn)行了系統(tǒng)、深入研究，取得了一系列豐碩的成果。提出糖尿病潰瘍病機(jī)演變的特點(diǎn)為“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p”，其中“虛”、“瘀”是創(chuàng)面難以愈合的主因。根據(jù)《醫(yī)林改錯(cuò)》所述“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)力，必停留而瘀”等中醫(yī)藥理論，建立“益氣化瘀法”貫穿疾病治療始終的新觀點(diǎn)，確立了“益氣化瘀法”的治療法則和系列方劑，形成了“益氣化瘀法治療糖尿病潰瘍”的學(xué)術(shù)思想體系，明顯提高了糖尿病潰瘍的臨床療效，同時(shí)一定程度上能緩解瘢痕形成，提高愈合質(zhì)量［7］。

隨著近年來(lái)分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對(duì)糖尿病創(chuàng)面愈合機(jī)制及瘢痕形成的研究日趨深入。增生性瘢痕是臨床常見(jiàn)的病理性瘢痕，其病理基礎(chǔ)是以成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞成分的過(guò)度增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積。TGF-β是一種重要的血管形成因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，在潰瘍創(chuàng)面組織中含量的變化對(duì)潰瘍發(fā)生、修復(fù)愈合發(fā)揮核心作用，同時(shí)TGF-β也是公認(rèn)為最強(qiáng)的致纖維化因子，是影響瘢痕形成的關(guān)鍵因素［8～9］。TGF-β可能通過(guò)增加Ⅰ、Ⅲ型膠原（特別是Ⅰ型膠原）沉積，抑制膠原酶活性、促進(jìn)纖維粘連蛋白（FN）表達(dá)等因素，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致組織纖維化，瘢痕形成［10］。Sm ads蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)特異轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β調(diào)控信息的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它們可將TGF-β信號(hào)直接從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，并激活靶基因的轉(zhuǎn)入［11～12］，目前已被公認(rèn)為修復(fù)相關(guān)基因，與創(chuàng)面的愈合有密切的關(guān)系。ALK是TGF-β的Ⅰ型受體，與其配體結(jié)合傳導(dǎo)信號(hào)。Sm ad是TGF-β的胞漿遞質(zhì)，參與TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)。最新研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族信號(hào)傳導(dǎo)有2條通路：一條是TGF-β/ALK1/Sm ad1/5途徑，與新生血管形成有關(guān)；另一條是TGF-β/ALK5/Sm ad2/3途徑，拮抗ALK1信號(hào)通道，并與纖維化有關(guān)［13］。對(duì)動(dòng)物臟器纖維化模型研究結(jié)果表明，采用小分子抑制劑抑制ALK5活性可降低臟器中纖維化基因表達(dá)和膠原沉積，減少纖維化程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病對(duì)照組ALK5/Sm ad2/3明顯高于正常對(duì)照組，提示糖尿病性潰瘍難以愈合及瘢痕形成的原因可能與之有關(guān)。益氣化瘀組及其拆方組能不同程度的抑制ALK5/Sm ad2/3通路，且益氣化瘀組更優(yōu)于其拆方組。由此可以認(rèn)為，抑制ALK5/Sm ad2/3通路可能是益氣化瘀中藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成的途徑之一，初步印證了“補(bǔ)虛生肌”“化瘀生肌”的學(xué)術(shù)理論。同時(shí)，益氣化瘀組更優(yōu)于拆方組更進(jìn)一步說(shuō)明，益氣法與化瘀法合用，能更大程度的逆轉(zhuǎn)“因虛致瘀”“瘀阻傷正”的致?lián)p病機(jī)，更體現(xiàn)中醫(yī)相須配伍的科學(xué)性。

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（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effects o f Chinese Herbs o f Rep lenishing Qi and Reso lving Stagnation on Pathw ays o f TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 o f Granu lation-p ro liferative Skin U lcers in Diabetic Rats

ZHANG Zhen，QUE Huafa

Objective：To explore the effect of Chinese herbs of replenishing qiand resolving stagnation on the pathw ays of TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 of skin ulcers at granulation proliferative stage in diabetic rats.Methods：Fifty rats w ere random ly divided into five groups：replenishing qiand resolving stagnation（RQRS）group，replenishing qi（RQ）group，resolving stagnation（RS）group，diabetes control（DC）group，and norm al control（NC）group.Diabetes m odelw as induced by peritoneal injection of streptozotocin and skin ulcers w ere caused by surgery m ethod in rats.And then the expression of ALK5，Sm ad2 and Sm ad3 w as detected w ith the m ethod of W estern blotting.Results：The levels of ALK5/Sm ad3 of the DC group w ere higher than those of NC group.The levels of ALK5/Sm ad2/3 of all the m edication groups w ere low er than those in DC group，and those in RQRS group w ere low er than those in RQ and RS groups.Conclusion：The therapy of rep lenishing qiand resolving stagnation can accelerate the w ound healing and reduce the scar form ation probably bym odulating the pathw ays of TGF-β/ALK5/Smad2/3.

Diabetes mellitus；Ulcer；Therapy of rep lenishing qi and resolving stagnation；Pathw ays of TGF-β/ALK5/ Sm ad2/3

R587.2

A

0256-7415（2015）06-0270-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.127

2015-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81202698）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173266）；上海市海派中醫(yī)傳承研究項(xiàng)目（ZYSNXD-CC-APGC-JD002）

張臻（1977-），女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)外科學(xué)。