厙守權(quán)， 劉 剛， 李 妍， 金美松， 孫衛(wèi)平， 康東周

（延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林　延吉　133002）

紅曲霉-人參雙向固體發(fā)酵產(chǎn)物成分變化的初步分析

厙守權(quán)， 劉 剛， 李 妍， 金美松， 孫衛(wèi)平， 康東周*

（延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133002）

目的 利用TLC和HPLC定性分析紅曲霉-人參粉末雙向固體發(fā)酵產(chǎn)物主要成分的變化。方法 紅曲霉接種于以人參為發(fā)酵基質(zhì)的固體培養(yǎng)基。取人參和人參發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇提取液，TLC測(cè)定它們的酸式monacolin K，HPLC法測(cè)定其人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rg3。結(jié)果 人參經(jīng)過(guò)紅曲霉發(fā)酵后，TLC檢測(cè)出活性成分酸式monacolin K，HPLC證實(shí)了人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含有量降低，但發(fā)酵液中出現(xiàn)人參皂苷Rg3。結(jié)論 紅曲霉-人參粉末雙向固體發(fā)酵使人參皂苷轉(zhuǎn)化成稀有的人參皂苷Rg3，并保存紅曲霉中的酸式monacolin K.

紅曲霉；人參；發(fā)酵；TLC；HPLC；酸式monacolin K；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參Rg3

紅曲霉是藥食兩用真菌，在我國(guó)的應(yīng)用已有千年的歷史［1-2］。紅曲霉擁有強(qiáng)大的酶系［3］，在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物monacolin K，1979年日本學(xué)者遠(yuǎn)藤章從紅曲酶發(fā)酵液中分離得到［4-5］，并發(fā)現(xiàn)其為HMG-CoA還原酶的抑制劑，能夠抑制膽固醇的生物合成［6］。科學(xué)家們經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)證明monacolin K在降低膽固醇方面具有高效、低毒、安全等特點(diǎn)。

人參享有“中藥之王”的美稱(chēng)，被人類(lèi)應(yīng)用于藥物治療方面已有上千年的歷史。人參皂苷是人參的主要藥用活性成分之一［7-8］，尤其是人參皂苷Rg3和Rh2具有很強(qiáng)的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、保肝、增強(qiáng)免疫力和保護(hù)心血管的作用。但是Rg3和Rh2這種稀有人參皂苷在人參中含有量極低［9］。

現(xiàn)階段，微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥的研究成為熱點(diǎn)，其具有改變藥性，提高療效，降低毒副作用，擴(kuò)大適應(yīng)癥等特點(diǎn)［10］。二十世紀(jì)80年代末，“藥用真菌新型（雙向性）固體發(fā)酵工程”簡(jiǎn)稱(chēng)“雙向發(fā)酵”正式問(wèn)世［11］。機(jī)理是采用不同的中藥材組成不同的“藥性基質(zhì)”的底物，在現(xiàn)代生物技術(shù)嚴(yán)密控制下，通過(guò)接種不同的單株藥用真菌，發(fā)生一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)與生化反應(yīng)。這樣的組合既提供了真菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，也能使藥性基質(zhì)的成分和組織分解、變化，并產(chǎn)生新的成分，得到的發(fā)酵終產(chǎn)物兼具藥用真菌和中藥材的功效，最終使發(fā)酵作用演變成雙向性［12-14］。本實(shí)驗(yàn)利用藥用真菌紅曲霉菌固體發(fā)酵人參，為紅曲霉-中藥材雙向發(fā)酵體系藥用價(jià)值的深層次挖掘和開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為中草藥的二次開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1供試材料 人參，購(gòu)于延邊參茸總公司，由延邊大學(xué)藥學(xué)院呂慧子副教授鑒定為人參Panaxginseng C.A.Mey的根部；紅曲酶菌株，由韓國(guó)KCCM提供。

1.1.2藥品試劑 Monacolin K對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)100600-201102），人參皂苷對(duì)照品Rg1（批號(hào)110703-200726），Re（編號(hào)110804），Rb1（批號(hào)110704-200420）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，Rg3（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)110754-201123）；甲醇、乙腈（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific）；正丁醇、三氯甲烷、石油醚、苯、濃硫酸、無(wú)水乙醇、甲酸均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備 HITACHI-2000型高效液相色譜儀（日本日立公司）；FA604型電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；YQ-620B型超聲波清洗機(jī)（上海易凈超聲波儀器有限公司）；HZQ-F100型振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；DNP-9162BS-III型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；SW-CJ-IC型凈化工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；DSX-280B型不銹鋼手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)）。

1.3方法

1.3.1紅曲霉發(fā)酵人參 在超凈工作臺(tái)上，將紅曲菌種轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)好的斜面菌種轉(zhuǎn)接于搖瓶種子培養(yǎng)液中，放入搖床培養(yǎng)箱中，在一定溫度和轉(zhuǎn)數(shù)下培養(yǎng)48 h。取一定量的搖瓶種子液，接種于以人參為發(fā)酵基質(zhì)的固體培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，一定溫度下培養(yǎng)若干天。

1.3.2TLC法檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中的monacolin K 取適量monacolin K對(duì)照品2份，用甲醇配制成0.1%的溶液，為內(nèi)酯式monacolin K對(duì)照品溶液，加入適量0.1 mol/LNaOH-75%乙醇［15］，60℃水浴2 h，得酸式monacolin K對(duì)照品溶液。再取適量發(fā)酵產(chǎn)品，按固液比1∶10加蒸餾水，放入振蕩培養(yǎng)箱中，30℃，150 r/min振蕩3 h。振蕩結(jié)束后離心10 min，棄上清液，得殘?jiān)?。干燥殘?jiān)侔垂桃罕?∶20加入石油醚，70℃回流提取90 min，之后離心10 min，棄上清液，得殘?jiān)?。干燥殘?jiān)侔垂桃罕?∶20加入甲醇，70℃回流提取4 h，之后提取液離心，取上清液，濃縮至適量，得供試品溶液。取TLC板，105℃活化45 min，待冷卻后，取供試液與對(duì)照品溶液在TLC板上同時(shí)展開(kāi)，展開(kāi)劑為苯-甲醇-三氯甲烷-甲酸（24∶2∶2∶0.5），展開(kāi)結(jié)束后吹干，用10%硫酸-乙醇顯色，觀(guān)察效果。

1.3.3TLC法檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的成分變化 分別取人參皂苷Rg1、Rg3對(duì)照品1 mg加入1 mL甲醇溶解，配制成對(duì)照品溶液。再分別取干人參和人參發(fā)酵產(chǎn)物適量，加入適量甲醇，超聲提取3 h，之后離心，取上清液。蒸干上清液，殘?jiān)眠m量蒸餾水溶解，并加入等體積的水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，取上層液體與對(duì)照品溶液同時(shí)在TLC板上展開(kāi)，展開(kāi)劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10），10℃下放置分層的下層液體［16］。展開(kāi)結(jié)束后吹干，用10%硫酸-乙醇顯色，觀(guān)察效果。

1.3.4HPLC法測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的成分變化

1.3.4.1色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈-1.3%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～30 min，乙腈19%；30～35 min，乙腈19%～24%；35～80 min，乙腈24%～50%），體積流量為0.8 mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，進(jìn)樣量為20μL。

1.3.4.2對(duì)照品的制備 將人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg3對(duì)照品分別用甲醇配制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，用于HPLC檢測(cè)。

1.3.4.3供試液的制備 分別取干人參和人參發(fā)酵產(chǎn)物適量，加入適量甲醇，超聲提取3 h，之后離心，取上清液。蒸干上清液，殘?jiān)眠m量蒸餾水溶解，并加入等體積的水飽和正丁醇進(jìn)行萃取，萃取后取上層液體，將所取上層液體蒸干后溶于適量的色譜級(jí)甲醇中，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，用于HPLC檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1精密度試驗(yàn) 精密吸取Rg3對(duì)照品溶液20 μL，按照色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，人參皂苷Rg3的峰面積RSD值為0.8%，小于5.0%，表明所用儀器的精密度良好。

2.1.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取Rg3對(duì)照品溶液20 μL，按照色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，分別在0、4、8、12、24、48 h后連續(xù)進(jìn)樣，記錄峰面積，人參皂苷Rg3的峰面積RSD值為1.1%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密吸取20μL Rg3對(duì)照品溶液6份，按照色譜條件分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，人參皂苷Rg3的峰面積RSD值為1.8%，小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2TLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中monacolin K的定性分析結(jié)果 如圖1所示，發(fā)酵樣品與內(nèi)酯式和酸式monacolin K對(duì)照品相比較，酸式monacolin K對(duì)照品的斑點(diǎn)明顯可見(jiàn)，說(shuō)明紅曲酶-人參發(fā)酵產(chǎn)物中含有酸式monacolin K。

2.3TLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的定性分析結(jié)果 如圖2所示，發(fā)酵人參樣品與Rg3在相同的Rf值處有斑點(diǎn)出現(xiàn)，而未發(fā)酵人參則沒(méi)有斑點(diǎn)出現(xiàn)，初步證明發(fā)酵人參當(dāng)中含有人參皂苷Rg3。

2.4HPLC法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中人參皂苷的定性分析結(jié)果 根據(jù)圖3，色譜峰1、2分別為人參皂苷Rg1、Re色譜峰，色譜峰5為人參皂苷Rb1色譜峰，色譜峰Rg3為色譜峰9。人參皂苷Rg1、Re、Rb1在發(fā)酵中發(fā)生轉(zhuǎn)化，含有量降低，人參經(jīng)過(guò)發(fā)酵得到人參皂苷Rg3，其轉(zhuǎn)化機(jī)制尚待研究。從HPLC圖還可看出其他色譜峰高略有變化，具體化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。

圖1　紅曲樣品的TLC圖譜Fig.1 TLC chromatogram of Monascus product

圖2　人參樣品TLC圖Fig.2 TLC chromatogram of Ginseng

3　討論

對(duì)紅曲霉所產(chǎn)生的monacolin K定性分析檢測(cè)。由于monacolin K在酸性條件下以酸式和內(nèi)酯式兩種形式存在，他們處于一種相互轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)平衡中［17］，兩者的結(jié)構(gòu)只是在母核上兩處支鏈結(jié)構(gòu)有微小區(qū)別，而且兩者的極性極其相近，利用高效液相色譜法對(duì)monacolin K進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，兩者在相同波長(zhǎng)處的峰在同一處不易分開(kāi)，這就為其定性造成了一定的困難。所以利用薄層色譜法對(duì)monacolin K定性，但對(duì)色譜系統(tǒng)的要求也很高，需要找出合適的展開(kāi)劑種類(lèi)及展開(kāi)比例，以達(dá)到內(nèi)酯式mona-colin K和酸式monacolin K的良好分離。

圖3　人參HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograph map of Ginseng

人參皂苷的變化是由于微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)人參皂苷的某一部位或某幾個(gè)部位的特定轉(zhuǎn)化而獲得一定的產(chǎn)物［18］。本實(shí)驗(yàn)中利用紅曲霉發(fā)酵人參，根據(jù)TLC和HPLC圖譜可知人參皂苷發(fā)生了轉(zhuǎn)化，并成功轉(zhuǎn)化出人參稀有皂苷Rg3，轉(zhuǎn)化機(jī)理可能為人參皂苷Rb1經(jīng)過(guò)酶的水解作用在C20位脫去一個(gè)葡萄糖苷生成人參皂苷Rd，再經(jīng)進(jìn)一步水解生成人參皂苷Rg3［19］如圖4所示?；蛘呷藚⒃碥誖b2和Rc在不同的酶的作用下改變了C3和C20上的糖鏈結(jié)構(gòu)最終轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rg3［20］，如圖5所示。具體的轉(zhuǎn)化路線(xiàn)還有待于進(jìn)一步的研究考證。

從結(jié)果中可以得出，發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)出活性成分酸式monacolin K和人參稀有皂苷Rg3，發(fā)酵產(chǎn)物兼具紅曲霉和人參主要活性成分，紅曲霉具有一定的轉(zhuǎn)化人參皂苷的能力，人參皂苷成分發(fā)生變化，并轉(zhuǎn)化出人參皂苷Rg3，使發(fā)酵具有雙向性。

圖4　人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3反應(yīng)機(jī)理圖Fig.4 Reaction mechanism of ginsenoside Rb1converted into Rg3

圖5　人參皂苷Rb2和Rc轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3的反應(yīng)機(jī)理圖Fig.5 Reaction mechanism of ginsenoside Rb2and Rc converted into Rg3

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Chem ical changes in M onascus-Ginseng product after bi-directional solid fermentation

SHE Shou-quan， LIU Gang， LIYan， JIN Mei-song， SUNWei-ping， KANG Dong-zhou*
（College of Pharmacy，Yanbian Uniυersity，Yanji133002，China）

AIM To analyze the constituent changes in the products ofmedicinal fungi Monascus and Ginseng powder after the bi-directional solid fermentation by TLC and HPLC.METHODS By inoculating Ginseng powder with Monascus，TLC was used tomeasure the acid form monacolin K content and the contents of ginsenoside Rg1，Re，Rb1，and Rg3ofmethanolic extracts were determined from Ginseng and Ginseng fermented broth by HPLC. RESULTS The TLC showed that therewas acid form monacolin K contained in Monascus-Gnseng fermented product.HPLCmethod proved thata slight decrease in contents of ginsenosides Rg1，Re and Rb1，but ginsenoside Rg3appeared in Ginseng fermented broth.CONCLUSION Monascus-Ginseng bi-directional solid fermentationmakes ginsenosides convert to ginsenoside Rg3which is rare in Ginseng and does not destroy acid form monacolin K from Monascus in fermented broth.

Monascus；Ginseng；fermentation；TLC；HPLC；acid form monacolin K；ginsenoside Rg1；ginsenoside Re；ginsenoside Rb1；ginsenoside Rg3

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.030

2014-04-12

厙守權(quán)（1986—），男，碩士生，研究方向?yàn)楣δ鼙＝∈称贰el：13199540256，E-mail：327719006@qq.com

康東周，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣δ鼙＝∈称?。Tel：（0433）2436012

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0599-05