金其貫，吳尚琳，王云峰，金愛娜，胡要娟

學習記憶是大腦的高級神經(jīng)功能之一，學習主要是指人或動物通過神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境信息而影響自身行為的過程，記憶是指獲得的信息或經(jīng)驗在腦內(nèi)儲存和提取（再現(xiàn)）的神經(jīng)活動過程，兩者密切相關(guān)［7］。而海馬是大腦中負責學習和記憶的最主要的部位，海馬的突觸可塑性是學習和記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)。研究證實，神經(jīng)生長相關(guān)蛋白-43（neuronal growth-associated protein，GAP-43）、突 觸 素（synaptophysin，SYP）和神經(jīng)細胞粘附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）與海馬突觸可塑性的形成有著密切的關(guān)系，是反映突觸可塑性的重要分子標志［5］。有研究表明，長期的高原缺氧環(huán)境可以影響海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，抑制大鼠的學習記憶能力［14，28］，而長期適量的運動訓練可以增加海馬突觸的可塑性來提高學習記憶能力［29-30］。雖有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧訓練結(jié)合體育鍛煉可以擴大運動改善老年人的認知能力和生活質(zhì)量的積極效應(yīng)［26］，但高原訓練對學習記憶能力的影響及其與海馬突觸可塑性的關(guān)系目前尚未見到報道。本研究通過交互設(shè)計的實驗方案，分別對大鼠進行8周的低氧暴露或／和有氧運動訓練，在測定大鼠學習記憶能力的同時，觀察了大鼠海馬的超微結(jié)構(gòu)，測定海馬組織中GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達量，來探討低氧和運動訓練對大鼠學習記憶的作用和交互作用及其與海馬突觸可塑性之間的關(guān)系，為進一步研究在高原訓練中機體學習記憶能力的變化及其機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與飼養(yǎng)

6周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重160～180g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，飼養(yǎng)室溫20±2℃，自然光照，每天定時更換墊料。采用國家標準嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水進食。大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3天后隨機分成常氧對照組（Normoxic control group，NC）、低 氧 對 照 組 （hypoxia control group，HC）、常氧運動組（Normoxic exercise group，NE）和低氧＋運動訓練組（hypoxia exercise group，HE）4組，每組10只。

1.2 實驗方案

運動訓練采用無負重游泳運動，每天下午訓練1次，每周訓練6天。第1周進行適應(yīng)性訓練，在1周內(nèi)運動時間逐漸增加到60min，共訓練8周。游泳池為120cm×80 cm×70cm的長方體塑料水桶，內(nèi)壁光滑，水深50cm，水溫30～33℃。游泳時注意觀察大鼠狀態(tài)，預防溺水死亡，并及時撈出大鼠糞便，保持池水清潔。前2周內(nèi)將低氧艙模擬海拔高度由1600m逐漸增加到3000m高度，最終氧濃度為14.2%。在取材時NC組1只大鼠用做海馬定位實驗，訓練中HC組、NE組各有2只大鼠、HE組有3只大鼠溺亡。

實驗第8周時，在Morris水迷宮中進行定位航行試驗的訓練，共5天。從第1天開始，每天上午8:00—11:00定時訓練，每天3次，每次訓練間隔60s。訓練時從第一、第二、第四象限依次（平臺設(shè)在第三象限）進行，并將大鼠面向池壁放入水中，記錄120s內(nèi)尋找并爬上平臺的路線圖及所需要的時間（即潛伏期），允許在平臺上停留10s，加強記憶效果。如果大鼠在規(guī)定的試驗時間120s內(nèi)未找到平臺，須將其引導至平臺，同樣允許在平臺上停留10s。第6天進行定位航行測驗，取3次潛伏期平均值作為其每一個訓練時間段的潛伏期；在第6天下午進行空間探索測驗，即移去平臺，從同一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，測定大鼠在120s內(nèi)游過的軌跡以及跨過平臺相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.3 取材

大鼠在 Morris水迷宮測驗完畢后，禁食12h，按50 mg／kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉，用剪刀斷髓處死后，小心剪開顱骨，取出右側(cè)海馬組織，放入2.5%戊二醛溶液中固定，備作電鏡制樣。取左側(cè)海馬組織，用錫箔紙包裹后立即置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃保存，以備提取總RNA，測定海馬組織中GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達量。

1.4 指標測試

從戊二醛溶液中取出海馬組織，常規(guī)包埋、制片，用Tecnai 12型透射電鏡觀察海馬組織的超微結(jié)構(gòu)，攝片并存檔。透射電鏡切片的制備和觀察均在揚州大學測試中心進行。GAP-43、SYP、NCAM mRNA采用RT-PCR測定，先用Trizol（購自Life technologies）法從海馬組織中提取總RNA后，采用NanoDrop ND-3300微量分光光度計檢測260／280吸光度比值，判斷RNA純度和濃度。按照cDNA合成試劑盒（購自上海東洋紡生物科技有限公司）中說明書上的操作步驟，使用2720Thermal Cycler梯度PCR儀（美國）進行cDNA合成，反應(yīng)結(jié)束后，在-20℃條件下保存。然后，使用SYBR Green Master（ROX）試劑盒（購自Roche Diagnostics），以cDNA 為 模 板，GAPDH 為 內(nèi) 參，用 ABI 7500RT-PCR儀進行基因擴增。擴增程序為:50℃預處理2min，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃退火60s共進行40個循環(huán)。程序運行結(jié)束后，將目的基因的Ct值與內(nèi)參GAPDH進行標準化，計算出目的基因的相對表達量。GAP-43、SYP、NCAM和GAPDH的引物均由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成（表1）。

表1 本研究目的基因的引物序列一覽表Table 1 Primer Sequences for Target Genes

1.5 統(tǒng)計處理

2 研究結(jié)果

2.1 各組大鼠潛伏期的變化和穿越平臺次數(shù)的變化

通過對NC、HC、NE和 HE 4組進行雙因素方差分析可知，長期的低氧暴露可使大鼠的潛伏期顯著增加（P＜0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著減少（P＜0.05），運動訓練能使大鼠的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），低氧聯(lián)合運動訓練對縮短大鼠潛伏期、提高大鼠穿越平臺次數(shù)均沒有顯著的交互作用（P＞0.05，表2）。

表2 本研究各組大鼠潛伏期和穿越平臺次數(shù)的變化一覽表Table 2 The Changes of Llatency and Times of Cross Platform in Each Group of Rats

2.2 各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化

圖1 本研究各組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化Figure 1 The Changes of Hippocampal Ultrastructure in Each Group of Rats

如圖1所示，NC組大鼠海馬突觸間隙清晰，突觸后膜致密物質(zhì)（PSD）厚度大，突觸前膜內(nèi)聚集有突觸小泡，線粒體數(shù)量多，結(jié)構(gòu)清晰；HC組大鼠海馬突觸數(shù)量少，突觸間隙模糊不清，突觸的界面較小，線粒體變形且結(jié)構(gòu)模糊。NE組大鼠海馬突觸數(shù)量多，突觸間隙清晰，突觸的界面曲度大，PSD厚度增大而明顯，突觸前膜內(nèi)聚集豐富的突觸小泡，線粒體數(shù)量增加，且結(jié)構(gòu)清晰。與NE組相比，HE組大鼠海馬內(nèi)突觸數(shù)量以及突觸小泡數(shù)量有所減少，PSD厚度減小，線粒體數(shù)量少，且結(jié)構(gòu)模糊不清。

2.3 各組大鼠海馬GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達的變化

對NC、HC、NE、HE 4組進行單因素方差分析可知，長期運動訓練可使大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），低氧暴露可使大鼠海馬區(qū) GAP-43、NCAM mRNA表達顯著降低（P＜0.05），SYP mRNA表達下降，但無顯著性差異（P＞0.05），低氧聯(lián)合運動訓練對提高GAP-43、SYP、NCAM mRNA的表達沒有顯著的交互作用（P＞0.05，表3）。

表3 本研究各組大鼠海馬GAP-43、SYP、NCAM、mRNA表達一覽表Table 3 Expression of Hippocampal GAP-43、SYP NCAM、mRNA in Each Group of Rats

3 分析與討論

3.1 低氧和運動對大鼠學習記憶能力的影響

有研究表明，高原缺氧可使機體的學習記憶能力下降，并導致機體的認知功能障礙，且隨著海拔高度和缺氧程度的增加，其抑制能力增加［9］。而適量、規(guī)律的運動鍛煉會顯著提高機體的學習記憶能力［13，20］，過度負荷的運動阻礙大鼠學習記憶能力的形成和保持［4］。關(guān)于高原訓練影響學習記憶能力的研究甚少，魏星研究發(fā)現(xiàn)，低氧和運動的雙重刺激，對大鼠的空間學習能力具有抑制作用，而對大鼠的空間記憶能力卻具有促進作用［6］。為了進一步探討高原訓練中低氧和運動兩個因素對學習記憶能力的作用和交互作用，本研究采用交互設(shè)計的實驗方案對大鼠進行8周氧濃度為14.2%的低氧暴露或／和60min的無負重游泳訓練，通過Morris水迷宮檢測各組大鼠的學習和記憶能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期的低氧暴露可使大鼠的潛伏期顯著延長（P＜0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著減少（P＜0.05），運動訓練能使大鼠的潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），低氧聯(lián)合運動訓練（模擬高原訓練）對縮短大鼠潛伏期、提高大鼠穿越平臺的次數(shù)沒有顯著的交互作用（P＞0.05）。由此進一步說明，長期的低氧暴露可以抑制機體的學習記憶能力，而適量的運動訓練可以提高機體的學習記憶能力，雖然運動訓練在一定程度上可以減輕低氧暴露所引起的學習記憶能力的抑制，但是運動訓練并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露所造成的學習能力下降的現(xiàn)象。因此，長期居住在高原缺氧環(huán)境下的人們通過適當?shù)倪\動鍛煉可減輕低氧環(huán)境對學習記憶能力的影響，對改善低氧環(huán)境下機體的認知功能可能具有非常重要的作用。

3.2 低氧和運動訓練對大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響

突觸可塑性是指突觸在一定條件下調(diào)整功能、改變形態(tài)和增減數(shù)目的能力，包括突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和突觸傳遞效應(yīng)的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，海拔6000m的低氧環(huán)境可使大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元PSD厚度明顯降低，PSD長度縮短，突觸間隙相應(yīng)地增加［3］。2周的間歇性低氧暴露，可使大鼠海馬神經(jīng)元核膜輕度破壞和線粒體輕微腫脹，而4周的間歇性低氧暴露，可使大鼠海馬神經(jīng)元核膜嚴重破壞、細胞腫脹和溶解［16］。運動訓練可使大鼠海馬齒狀回的突觸數(shù)量以及線粒體數(shù)量明顯增加，促進突觸結(jié)構(gòu)可塑性改變［15］。低氧和運動的雙重刺激可抑制大鼠海馬齒狀回新生細胞的發(fā)生，氧濃度越低抑制作用越大［6］，但洪平（2005）研究6周不同形式的低氧訓練對大鼠海馬神經(jīng)元的影響發(fā)現(xiàn)，低住低練、高住低練和低住高練組的大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)正常，只有高住高練組海馬神經(jīng)元受到輕度損傷，并認為這是在持續(xù)性低氧的基礎(chǔ)上進行運動訓練加重了腦組織的缺氧所致［1］。

為了進一步探討模擬高原訓練對大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)可塑性的影響，本實驗通過讓大鼠模擬高原訓練8周，觀察大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，HC組大鼠海馬區(qū)突觸數(shù)量減少，突觸的界面變小，突觸間隙與線粒體變形且結(jié)構(gòu)模糊；NE組大鼠海馬區(qū)突觸數(shù)量增多，突觸的界面曲度增大，突觸間隙清晰，PSD厚度明顯增厚，突觸前膜內(nèi)突觸小泡數(shù)量增多，線粒體數(shù)量增加，且結(jié)構(gòu)清晰；與NE組相比，HE組大鼠海馬內(nèi)突觸數(shù)量以及突觸小泡數(shù)量有所減少，PSD厚度減小，線粒體數(shù)量少，且結(jié)構(gòu)模糊。從而進一步說明，長期的低氧暴露可以降低海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，適量的運動訓練可以增加海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，運動訓練雖然對低氧暴露大鼠海馬突觸的超微結(jié)構(gòu)的損傷有一定的保護作用，但并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露對大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)帶來的損傷。

3.3 低氧和運動訓練對海馬GAP-43、SYP、NCAM表達的影響

研究證實，GAP-43是神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)生長及再生、突觸形成和重建的標志性物質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性中起重要作用［25］；SYP是突觸小泡蛋白，并可作為突觸傳遞的標志物參與神經(jīng)元的傳輸［24］；而NCAM與突觸結(jié)構(gòu)維持、模式重建有密切關(guān)系［23］。因此，GAP-43、SYP、NCAM 是反映海馬突觸可塑性的重要分子標志物。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧極為敏感，很容易發(fā)生缺氧性損傷，而GAP-43、NCAM可能是神經(jīng)系統(tǒng)損傷后自我修復再生的重要因子［18，22］。有研究證實，慢性間歇缺氧引起腦損傷時GAP-43的表達瞬時升高，這種瞬時升高可能是由于缺氧刺激未受損的腦神經(jīng)元代償性地增加GAP-43的合成，促進腦損傷后神經(jīng)元再生與修復（注:以前人們一直認為腦發(fā)育成熟后其神經(jīng)元失去再生能力，但最近Nagavi等科學家們證實了多種生物的腦組織內(nèi)，甚至在具有高級神經(jīng)功能的新皮質(zhì)中有神經(jīng)元再生現(xiàn)象）；但隨著缺氧的進行，海馬神經(jīng)元損傷加重，抑制了海馬神經(jīng)元GAP-43的合成，導致GAP-43的表達逐漸降低［18］。慢性間歇性缺氧可使大鼠海馬區(qū)SYP的表達顯著降低［11］，缺氧缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)元SYP蛋白含量及mRNA表達均下降［19］，而SYP的表達直接引起突觸量化的改變，進而改變突觸可塑性。但是，長期的運動訓練對海馬GAP-43、SYP、NCAM的影響，由于實驗對象的不同，實驗結(jié)果不完全相同。長期、適量的運動訓練不僅可以促進正常大鼠海馬內(nèi)GAP-43、SYP和NCAM蛋白表達上調(diào)，而且可以促進衰老小鼠海馬GAP-43以及衰老大鼠海馬NCAM是mRNA和蛋白的表達增加，促進了空間學習記憶的形成和保持［4，8-10，17］。在對腦損傷的小鼠進行神經(jīng)干細胞／祖細胞移植的同時，進行適當?shù)呐芘_運動可以增加腦神經(jīng)生長因子和GAP-43mRNA的表達，使移植細胞分化成神經(jīng)元顯著增多［21］，且適當?shù)倪\動訓練也可以增加腦缺血大鼠海馬區(qū)SYP含量或mRNA的表達［2，27］，從而促進神經(jīng)功能的恢復，改善大鼠的空間學習記憶能力。另有研究發(fā)現(xiàn)，適當?shù)挠醒踹\動鍛煉能夠通過增加睡眠剝奪大鼠海馬GAP-43蛋白的表達來顯著改善長時間睡眠剝奪引起的記憶障礙，但是睡眠剝奪和有氧運動鍛煉均不能改變突觸蛋白1、SYP和PSD-95蛋白的表達［20］。然而，低氧聯(lián)合運動訓練對海馬GAP-43、SYP、NCAM表達的作用和交互作用目前尚未見到研究報道。

本研究采用交互設(shè)計的實驗方案對大鼠進行8周14.2%的低氧暴露或／和60min的無負重游泳訓練后，檢測了大鼠海馬區(qū) GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達。對NC、HC、NE、HE 4組進行雙因素方差分析后發(fā)現(xiàn)，長期的低氧暴露可使大鼠海馬區(qū)GAP-43、NCAM mRNA表達顯著降低（P＜0.05），SYP mRNA表達下降，但無顯著性差異（P＞0.05），長期運動訓練可使大鼠海馬區(qū) GAP-43、SYP和 NCAM mRNA表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），在低氧條件下進行運動訓練對于提高GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達沒有顯著的交互作用（P＞0.05）。由此可見，長期的低氧暴露或運動訓練時大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達變化與突觸超微結(jié)構(gòu)的變化以及學習記憶能力變化相一致。說明長期的低氧暴露或運動訓練通過引起海馬GAP-43、SYP和NCAM mRNA表達的下調(diào)或上調(diào)，抑制或增強海馬突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，可能是影響學習記憶能力的重要機制。

4 結(jié)論

1.長期的低氧暴露可抑制學習記憶能力，而運動訓練能夠增加學習記憶能力，雖然運動訓練在一定程度上可以改善低氧暴露大鼠的學習記憶能力，但并不能完全逆轉(zhuǎn)低氧暴露所造成的學習能力下降。

2.長期的低氧暴露或運動訓練時大鼠海馬區(qū)GAP-43、SYP、NCAM mRNA表達變化與突觸超微結(jié)構(gòu)的變化以及學習記憶能力變化相一致。長期的低氧暴露或運動訓練通過下調(diào)或上調(diào)海馬GAP-43、SYP和NCAM mRNA的表達，抑制或增強海馬突觸結(jié)構(gòu)的可塑性，可能是影響學習記憶能力的重要機制。

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