郭 華， 朱智甲*,2， 周曉雅， 吳 文

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620；2.東華大學(xué)生態(tài)紡織品教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620)

氨基酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且類似，但大多數(shù)氨基酸分子沒有熒光和生色基團(tuán)，難以直接區(qū)分和檢測(cè)，因此柱前或柱后衍生化是提高和改善氨基酸檢測(cè)靈敏度的有效途徑。常用的衍生化試劑有：鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴基甲氧基羰酰氯、異硫氰酸苯酯和丹酰氯等。其中，OPA與氨基酸衍生化反應(yīng)步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速(<30 s)、衍生物可用多種檢測(cè)器檢測(cè),因而被廣泛應(yīng)用[1,2]。

目前,報(bào)道的氨基酸分析方法主要有：毛細(xì)管電泳法[3，4]、離子交換色譜法[5，6]、柱前衍生-氣相色譜法[7，8]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[9]和液相色譜法[10，11]。這些方法靈敏度和重現(xiàn)性不夠理想，而且基體干擾大，而液-質(zhì)聯(lián)用法報(bào)道較少[12]。本文以O(shè)PA為柱前衍生化試劑、利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)，建立了分析氨基酸的新方法，并用于珍珠粉中氨基酸檢測(cè)，有效克服了樣品基體的影響。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高、分析速度快、具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Varian 310三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，瓦里安公司)，配有Varian Prostar210高效液相色譜儀、Varian 410自動(dòng)進(jìn)樣器、Varian workstation數(shù)據(jù)處理軟件與電噴霧離子源(ESI)。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)和亮氨酸(Leu)均為Sigma產(chǎn)品。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100 μg/mL)：準(zhǔn)確稱取一定量氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，用pH=10.5緩沖溶液配成25 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。各級(jí)氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由儲(chǔ)備液用緩沖溶液逐級(jí)稀釋即可。衍生試劑的配制：準(zhǔn)確稱取0.0200 g OPA于10 mL容量瓶中,用1 mL甲醇溶解,加入20 μL巰基丙酸，用甲醇定容，震蕩均勻后，儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱中待用。pH=10.5的硼酸-NaOH緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)用水為去離子重蒸水。

1.2 色譜與質(zhì)譜條件

1.2.1色譜條件色譜柱：Welch Topsil C18柱(150×2.1 mm,3 μm)；流動(dòng)相：10 mmol/L HAc-NH4Ac溶液(A)∶乙腈(B);流速:0.3 mL/min;線性梯度：0～2 min,5%B;4～20 min,70%B;21～30 min,5%B;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源,正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；噴霧針電壓：5 500 V；篩板電壓：600 V；霧化氣溫度及壓力：250 ℃、50 psi；干燥氣溫度及壓力：300 ℃、22 psi；檢測(cè)電壓：1 200 V。

1.3 樣品前處理

稱取珍珠粉約10 g于500 mL燒杯中，加入10 mL水調(diào)成糊狀。攪拌下緩慢分次加入6 mol/L HCl酸化4次(每次10 mL)，放置待泡消退后抽濾，以水洗滌至洗液呈中性，得黃色粗蛋白，備用。稱取粗蛋白約10 mg 于15 mL 耐溫耐壓瓶中，準(zhǔn)確加入5 mL 6 mol/L HCl，加蓋密封，于溫度110 ℃下水解24 h。取出放冷，將水解液移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，殘?jiān)运芙?，移?0 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，微孔濾膜過濾即可[13]。

1.4 衍生及分析

準(zhǔn)確移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液于1 mL小試管中,加入50 μL衍生化試劑,充分混勻，避光反應(yīng)2 min，用0.22 μm濾膜過濾，取20 μL 注入液-質(zhì)聯(lián)用儀分析,以碎片離子荷質(zhì)比定性,二級(jí)質(zhì)譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件的優(yōu)化

2.1.1緩沖溶液pH值和衍生化時(shí)間的選擇在pH=7.5～11范圍內(nèi)，考察了pH值對(duì)衍生反應(yīng)的影響，隨著pH值升高，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性增強(qiáng)，考慮到色譜柱耐受性，選擇10.5作為最佳pH值。另外，衍生反應(yīng)時(shí)間2 min后，衍生反應(yīng)已經(jīng)充分完成，因此本文選擇2 min作為衍生化反應(yīng)時(shí)間。

2.1.2OPA用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響考察了OPA與氨基酸摩爾比分別為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、50∶1時(shí)的反應(yīng)情況。結(jié)果表明，當(dāng)摩爾比≥10∶1時(shí)，衍生化反應(yīng)進(jìn)行完全，故選擇OPA與氨基酸的摩爾比為10∶1。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

圖1 7種氨基酸衍生物的色譜圖Fig.1 The chromatogram of 7 amino acid derivatives

分別采用甲醇-水、乙腈-水做流動(dòng)相，但甲醇體系柱壓高，且在正離子模式下加入HAc可以提高質(zhì)譜響應(yīng)，為了穩(wěn)定流動(dòng)相的pH,選用10 mmol/L HAc-NH4Ac體系。同時(shí)考察了流動(dòng)相0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min流速對(duì)分離的影響，柱壓隨著流速的增加而升高且分離度降低，本文選擇0.3 mL/min為最佳流速。為了實(shí)現(xiàn)氨基酸衍生物分離，本文采用梯度洗脫方式。總離子流圖見圖1。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

正離子模式下信號(hào)較強(qiáng)，因此采用正離子模式監(jiān)測(cè)。在全掃描模式下，獲得了氨基酸衍生物的母離子，在選擇離子掃描模式下優(yōu)化了裂解電壓；在子離子監(jiān)測(cè)模式下優(yōu)化了碰撞能量；依據(jù)在子離子掃描模式下，一般選擇除母離子之外豐度高且穩(wěn)定的離子為定量子離子原則，確定了相應(yīng)的定性和定量離子對(duì)。離子對(duì)、具體的毛細(xì)管電壓、碰撞能量如表1所示。

表1 氨基酸衍生物的MRM掃描參數(shù)

(續(xù)表1)

Amino acidDeeivativePrecursor ion(m/z)Product ion(m/z)Capillary(V)CE(V)352274?175502030310205?117502030379335?229401015294189?144602030336175?130402530370265?2206020

*quatitative ion.

2.4 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

準(zhǔn)確移取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法衍生化并進(jìn)行分析，以氨基酸濃度(c)為橫坐標(biāo)，二級(jí)質(zhì)譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。本文獲得的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、以及以三倍信噪比計(jì)算的檢出限(LOD)數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 氨基酸測(cè)定的線性范圍，回歸方程，精密度、檢出限與加標(biāo)回收率

2.5 精密度和加標(biāo)回收率

對(duì)1.0 μg/mL氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣7次，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果列于表2。對(duì)珍珠粉樣品溶液，添加0.50 μg/mL的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。

2.6 樣品分析

對(duì)某藥店購買的珍珠粉樣品，按照前處理方法制備樣品溶液，衍生化后進(jìn)行液-質(zhì)聯(lián)用分析，測(cè)得該品牌珍珠粉中7種氨基酸的含量依次為：Ala,0.057%；Asp，0.013%；Arg，0.001%；Glu，0.018%；Leu，0.11%；Phe，0.041%和Ser，0.034%。

3 結(jié)論

本文對(duì)珍珠粉進(jìn)行酸化水解，以鄰苯二甲醛為柱前衍生化試劑，采用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，建立了珍珠粉中氨基酸測(cè)定的新方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，選擇性好，靈敏度高，適用于珍珠粉樣品中氨基酸的測(cè)定。