李滿秀*, 任光明, 孫笑笑, 楊 艷, 丁 茹

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系,山西忻州 034000 )

L-半胱氨酸是20 種必需氨基酸中唯一含有活性巰基(-SH)的氨基酸，它具有一定生理功能，在醫(yī)藥、食品及化妝品行業(yè)中都有應(yīng)用。因此，研究L-半胱氨酸的測定方法具有現(xiàn)實意義。目前測定L-半胱氨酸有高效液相色譜法[1,2]、電位法[3,4]、熒光分析法[5]等。

量子點(QDs)作為一種新型熒光材料 ，具有激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜窄，可調(diào)諧的發(fā)射波長和抗漂白性等優(yōu)點，在定量分析中起著重要作用[6,7]。近幾年，基于量子點熒光猝滅-恢復(fù)技術(shù)建立的分析方法已有報道[8,9]，但用這種方法測定L-半胱氨酸的研究未見報道。本文以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，合成了水溶性的CdTe QDs，利用Ni2+對CdTe QDs熒光的猝滅，以及L-半胱氨酸使該體系熒光恢復(fù)的方法，建立了測定L-半胱氨酸的新方法，該方法操作簡單，選擇性和靈敏度高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(日本，日立公司)；UV-2550型紫外分光光度計(日本，島津公司)；pHS-3B型酸度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；78型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇金城國盛實驗儀器廠)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司(上海))；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；微量進樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。

L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取0.0121 g L-半胱氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司),用水溶解配成1.0×10-3mol/L 儲備液,4 ℃冰箱保存,工作液用水稀釋現(xiàn)配。Ni2+標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取0.0291 g Ni(NO3)2·6H2O(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)用水溶解，配成1.0×10-3mol/L儲備液，測定時逐級稀釋；NaBH4(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，巰基乙酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，碲粉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，CdCl2·2.5H2O (國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 量子點合成方法[10]

稱取碲粉0.1276 g,NaBH40.0800 g,置于三頸瓶中，加入二次蒸餾水3 mL，用真空泵排盡空氣且用氮氣保護，在冰水浴中和強磁力攪拌下進行反應(yīng)，4 h后停止反應(yīng)，靜置10 min，上層為無色的NaHTe水溶液，下層為白色固體Na2B4O7·10H2O，NaHTe水溶液易被氧化，應(yīng)密封保存。

在三頸燒瓶中加入100 mL 1.25×10-3mol/L CdCl2溶液,通高純氮氣30 min，加入巰基乙酸25 μL，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 至11.2，在氮氣保護下，迅速加入75 μL新制備的還原劑NaHTe。反應(yīng)液中Cd2+∶HTe-∶TGA 的摩爾比為1.00∶0.20∶2.40。在96 ℃水浴中回流3 h，即得水溶性CdTe QDs。

1.3 測定方法

1.3.1Ni2+對CdTeQDs熒光猝滅的測定在一系列5 mL比色管中加入 0.6 mL CdTe QDs，然后依次加入不同濃度的Ni2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，室溫下放置一段時間，于λex=400 nm處測定熒光強度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

1.3.2CdTeQDs熒光恢復(fù)法測定L-半胱氨酸在一系列5 mL比色管中加入 0.6 mL CdTe QDs，再加適量pH=10的硼砂緩沖溶液，加入一定量的Ni2+溶液，使其濃度為40×10-6mol/L，振搖后靜置15 min,再向其中加入不同濃度梯度的L-半胱氨酸溶液，然后用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，放置30 min,于λex=400 nm處測定熒光強度，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe Qds的光學(xué)性質(zhì)

圖1 CdTe QDs的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectrum of CdTe QDs

CdTe QDs的熒光光譜如圖1所示，固定激發(fā)波長λex=400 nm，測得最大發(fā)射波長λem=620 nm，從圖中可以看出熒光發(fā)射峰峰形對稱，說明合成的量子點有穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)。

2.2 Ni2+對CdTe QDs的熒光猝滅

在室溫下，往量子點中加入不同濃度的Ni2+標(biāo)準(zhǔn)溶液，用pH=10.0的硼砂緩沖溶液定容，測其熒光光譜。如圖2所示，隨著加入Ni2+加入量的增大，量子點的熒光猝滅程度不斷增大，且在2.0 ×10-7～ 4.5×10-5mol/L 范圍內(nèi)猝滅程度與Ni2+濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9992。量子點熒光猝滅的原因是由于量子點表面有大量的羧基和羥基官能團，與Ni2+形成復(fù)合物并覆蓋在量子點的表面，并與量子點發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生更多非輻射中心導(dǎo)致熒光猝滅。

2.3 L-半胱氨酸對猝滅后體系的熒光恢復(fù)

選擇最佳Ni2+的猝滅體系，在體系中加入不同濃度的L-半胱氨酸，量子點熒光得到了恢復(fù)，且隨著L-半胱氨酸濃度的增大，恢復(fù)程度不斷增大，如圖3所示。加入的L-半胱氨酸能與量子點表面復(fù)合物中Ni2+發(fā)生螯合作用，使原來覆蓋在量子點表面的復(fù)合物分解，量子點表面負(fù)電荷增加，周圍分子定向極化率提高，量子點表面得到恢復(fù)，因此CdTe熒光強度得以恢復(fù)。實驗表明加入L-半胱氨酸前后熒光強度的比值(F/F0)與其濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9990。

圖2 Ni2+對CdTe QDs的熒光猝滅 Fig.2 Fluorescence spectra of Ni2+ quenched CdTe QDs 1-7:cNi2+:0,2,6,10,18,30,45 μmol/L，respectively.

圖3 L-半胱氨酸對CdTe QDs的熒光恢復(fù)Fig.3 Effects of concentrations of L-cystine on fluorescence of CdTe QDs 1-7:cL·cystine:0,6,10,20,30,40,50 μmol/L,respectively.

2.4 溫度的影響

在溫度分別為25 ℃和32 ℃考察了溫度的影響。結(jié)果表明，溫度升高，量子點的熒光強度減弱，但Ni2+的濃度與熒光強度猝滅程度仍然呈良好的線性關(guān)系，因此在整個實驗中保持溫度為25 ℃。

2.5 緩沖溶液及pH的影響

圖4 pH對體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of pH on the fluorescence intensity

為獲得較好的猝滅效果和恢復(fù)效果，研究了不同緩沖溶液的影響。分別以硼砂緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液和磷酸鹽緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)，測定體系的熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硼砂緩沖溶液的效果最佳。進一步考察了不同pH的硼砂緩沖溶液對熒光恢復(fù)的影響，pH=10.0的反應(yīng)體系情況最佳，結(jié)果見圖4。

2.6 量子點和Ni2+濃度的影響

當(dāng)體系的熒光強度很強的時候，少量Ni2+的加入，熒光猝滅程度小，導(dǎo)致分析的靈敏度低；當(dāng)體系的熒光較弱時，少量Ni2+的加入，熒光猝滅程度較大，靈敏度高，但線性范圍窄。為了兼顧靈敏度和線性范圍，本實驗使用的CdTe QDs溶液濃度為2.5×10-4mol/L(以Cd2+計)，Ni2+濃度為40 μmol/L。

2.7 共存物質(zhì)的影響

在優(yōu)化實驗條件下對多種共存物質(zhì)進行干擾實驗，當(dāng)允許誤差為±5%，L-半胱氨酸的濃度為30 μmol/L時，各共存物質(zhì)的允許量(μmol/L)如下:Ca2+、Na+、Zn2+(200)，Mg2+、K+(160)，Ba2+、Al3+(120)，F(xiàn)e3+(20),苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸(200)，精氨酸、色氨酸、賴氨酸(160)，酪氨酸(200)，葡萄糖、淀粉(140)。

2.8 工作曲線、精密度與檢出限

在優(yōu)化的實驗條件下獲得L-半胱氨酸濃度與CdTe QDs 體系熒光恢復(fù)強度之間的關(guān)系。L-半胱氨酸在6.0×10-6～5.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與量子點熒光恢復(fù)程度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為:F/F0=0.0159c+0.998(c:μmol/L)，r=0.9990，方法檢出限(S/N=3)為2.1×10-6mol/L，對1.0×10-5mol/L L-半胱氨酸溶液進行10次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%。

2.9 樣品分析

取1 mL市售果汁于50 mL容量瓶中，用水定容;取2 g市售蜂蜜于燒杯中溶解，再轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用水定容。按照實驗方法測定蜂蜜和果汁樣品中L-半胱氨酸的含量并進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文在水相中合成CdTe QDs,利用CdTe QDs熒光猝滅-恢復(fù)技術(shù),建立了一種測定L-半胱氨酸的新方法。方法操作簡單,選擇性和靈敏度高,適用于果汁等樣品中L-半胱氨酸的測定,有較好的實用價值。