李杰鵬， 梁淑彩， 余 慧， 劉衍斌， 鄢國平

(1.武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北武漢 430074;2.武漢大學藥學院，湖北武漢 430072)

蛋白質(zhì)定量檢測在生命科學、臨床、醫(yī)療及衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要意義。采用熒光探針的熒光分析法因操作簡單、靈敏度高、選擇性好等特點在蛋白質(zhì)定量分析中有著舉足輕重的地位[1]。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)熒光探針有稀土離子[2]、金屬配合物[3]，及有機小分子化合物如熒光素類、花菁類和芳酸類染料[4-6]等。近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，熒光納米粒作為新興熒光探針引起了科研工作者的關(guān)注，基于無機材料的半導體納米晶[7,8]、金納米粒[9]和復合SiO2納米粒[10]等已用于蛋白質(zhì)的熒光分析測定。相比于無機納米熒光材料，聚合物熒光納米粒具有結(jié)構(gòu)可控，功能可設(shè)計及良好的生物相容性等顯著優(yōu)勢，在生物分析方面具有廣闊的應用前景，但目前用于蛋白質(zhì)測定的報道[11,12]不多。

聚丙烯酸(PAA)水溶性好且無毒性，在水處理、生物醫(yī)藥及石油化工等方面有較多應用[13]。1,8-萘酰亞胺熒光團光穩(wěn)定性好，Stokes位移大，對其進行結(jié)構(gòu)修飾可獲得具有高靈敏度和選擇性的熒光探針，在熒光分析測定方面的潛力已得到普遍認可[14,15]。本文以萘酰亞胺熒光化合物為交聯(lián)劑對PAA進行交聯(lián)，得到了水溶性的聚合物熒光納米粒。以444 nm為激發(fā)波長，該納米粒在544 nm處發(fā)射熒光，而牛血清白蛋白(BSA)能使其發(fā)射波長藍移至535 nm，且熒光顯著增強。據(jù)此，建立了一種快速、簡便和靈敏地測定蛋白質(zhì)的新方法。用該方法成功測定了BSA合成樣品及牛奶樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

LS55型熒光分光光度計(美國，Perkin Elmer公司)；UV-2550型紫外分光光度計(日本，島津公司)；Delta 320-S pH計(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)；JEM-100CXII型透射電鏡(日本，電子株式會社)。

N-羥乙基-4-羥乙基-1,8-萘酰亞胺(AN)按文獻方法[16]制備。聚丙烯酸(PAA，分子量為2.6萬)購于河南省凱特化學實業(yè)總公司。BSA購于Sigma公司，溶于水中配制成濃度為1.5×10-5mol·L-1的標準溶液，于冰箱中4 ℃保存。其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1納米粒的合成[16]4.0 mL氯化亞砜緩慢滴入溶有0.5 g聚丙烯酸的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，混合物在35±2 ℃下反應2 h后，減壓抽至無氣泡產(chǎn)生，得到聚丙烯酰氯溶液。1.0 g AN溶于DMF中，緩慢滴入上述溶液中，然后室溫攪拌反應5 h。將反應液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子量3 500 Da)于水中透析，每4 h換水一次，同時監(jiān)測透析液熒光強度(激發(fā)和發(fā)射波長分別為444 nm和544 nm)，透析液熒光強度為零時停止透析。將透析袋內(nèi)溶液減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥后即得目標納米粒(AN/PAA-NP)。

1.2.2納米粒的表征用水將納米粒溶解并稀釋至適當濃度測定其紫外光譜；用乙醇溶解AN配制1.0 mg·mL-1的儲備溶液，再用水稀釋至不同濃度，在444 nm下測定吸光度并繪制標準曲線。根據(jù)納米粒在444 nm處的吸光度和AN的標準曲線，利用文獻方法[17]計算熒光團的摩爾取代度。將待測液滴在表面噴涂碳膜的銅網(wǎng)上并進行負染，用透射電鏡(TEM)觀察形態(tài)和粒徑。

1.2.3蛋白質(zhì)檢測方法在10.0 mL比色管中，加入1.0 mL濃度為10.0 μg·mL-1的AN/PAA-NP溶液，1.0 mL 20.0 mmoL·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=3.0)及不同量的BSA標準溶液，用水定容后搖勻。室溫放置10 min，然后以444 nm為激發(fā)波長，在535 nm處測定試劑空白和反應體系的熒光強度F0和F，計算相對熒光強度△F(△F=F-F0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒的表征

PAA的羧基經(jīng)過酰氯化后與AN的羥基反應，形成PAA交聯(lián)的熒光納米粒，通過透析對其進行純化。紫外光譜測定結(jié)果(圖1)顯示，AN和AN/PAA-NP在444 nm處均有特征吸收，而PAA在可見光區(qū)沒有吸收峰，表明萘酰亞胺熒光團已經(jīng)固定于交聯(lián)PAA中，經(jīng)測定其摩爾取代度為1.38%。透射電鏡(TEM)結(jié)果(圖2)表明納米粒呈球狀，粒徑為10±5 nm。

圖1 PAA、AN和AN/PAA-NP的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of PAA,AN and AN/PAA-NP cPAA=0.2 mg·mL-1,cAN=2.5 mg·L-1,cAN/PAA-NP=0.1 mg·mL-1.

圖2 TEM測定AN/PAA-NP的形態(tài)和粒徑Fig.2 The morphology and size of AN/PAA-NP measured by TEM

圖3 AN/PAA-NP及AN/PAA-NP/BSA體系的激發(fā)與發(fā)射光譜Fig.3 Excitation and emission spectra of AN/PAA-NP and AN/PAA-NP/BSA system 1 and 1’ are excitation and emission spectra of AN/PAA-NP,respectively;2 and 2′ are excitation and emission spectra of AN/PAA-NP/BSA system,respectively.cAN/PAA-NP=2.0 μg·mL-1，cBSA=7.5 μmol·L-1.

2.2 AN/PAA-NP及AN/PAA-NP/BSA的熒光光譜

對AN/PAA-NP及AN/PAA-NP/BSA體系進行熒光光譜掃描，見圖3。可以看出，AN/PAA-NP的熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為444 nm和544 nm，加入BSA后，激發(fā)波長沒有變化，發(fā)射波長藍移至535 nm，同時熒光強度顯著增大，表明AN/PAA-NP可用于熒光增強法測定蛋白質(zhì)。

2.3 測定條件的優(yōu)化

2.3.1緩沖溶液pH值及用量的影響研究發(fā)現(xiàn)，酸性條件有助于AN/PAA-NP/BSA體系的熒光增強，而堿性條件下△F較小，當pH=3.0時△F最大(圖4)。另外，考察了pH=3.0的PBS(20.0 mmol·L-1)用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mL時，體系熒光強度的變化。結(jié)果表明當緩沖溶液用量大于1.0 mL時，△F趨于穩(wěn)定。本研究選擇加入pH=3.0的PBS 1.0 mL。

2.3.2AN/PAA-NP濃度的影響固定BSA的濃度，△F隨AN/PAA-NP濃度的變化見圖5。當AN/PAA-NP的濃度為1.0 μg·mL-1時，△F最大；提高納米粒濃度△F略有下降，且會增大背景熒光。實驗選擇1.0 μg·mL-1的AN/PAA-NP。

圖4 pH值對△F的影響Fig.4 Effect of pH values on △F cAN/PAA-NP=1.0 μg·mL-1，cBSA=3.0 μmol·L-1.

圖5 AN/PAA-NP濃度對△F的影響Fig.5 Effect of AN/PAA-NP concentrations on △F cBSA=3.0 μmol·L-1.

2.3.3反應時間的影響納米粒與BSA的結(jié)合反應進行很快，在室溫下5 min內(nèi)即完成，且體系熒光至少穩(wěn)定2 h。為了確保反應充分完全，在加入BSA溶液且定容后，放置10 min后再進行測定。

2.4 線性范圍、檢測限和精密度

在最佳測定條件下，以體系的△F對BSA濃度繪制標準曲線。結(jié)果表明，BSA濃度在0.15～7.5 μmol·L-1范圍內(nèi)與△F呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程為：△F=84.288cBSA+21.206，相關(guān)系數(shù)為0.9973(n=7)。對空白溶液平行10次測定，以3倍標準偏差計算得檢測限為0.095 μmol·L-1。按上述方法對濃度為1.5 μmol·L-1和4.5 μmol·L-1的BSA各進行10次測量，其相對標準偏差(RSD)分別為3.68% 和2.52%。

2.5 共存物質(zhì)的影響

固定BSA濃度為3.75 μmol·L-1，控制相對誤差在±5%范圍內(nèi)，考察常見物質(zhì)對測定的影響。結(jié)果表明， 50.0 μmol·L-1的Fe3+、Ni2+、Co2+、Li+、Ba2+、Mg2+、Mn2+，15.0 μmol·L-1的Hg2+、Cu2+、Zn2+對測定結(jié)果沒有影響。共存氨基酸(Arg、Ala、Leu、Gly、Trp、Phe、Thr、Tyr)的濃度為0.5 mmol·L-1時對測定也沒有影響。

2.6 樣品的測定

2.6.1人工合成樣品取濃度為50.0 μmol·L-1的Mg2+、Fe3+和Li+，20.0 μmol·L-1的Cu2+和Zn2+，100.0 μmol·L-1的Arg、Phe、Gly和Leu各0.5 mL,及一定量的BSA標準溶液混合后定容至10 mL得到合成樣品。取4.0 mL合成樣品按照實驗方法對BSA進行測定。測定結(jié)果見表1。

2.6.2牛奶樣品市售純牛奶稀釋100倍，取4.0 mL用標準加入法進行回收率實驗。測定結(jié)果如表1所示。

表1 樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

發(fā)展了一種以水溶性聚合物納米粒為熒光探針，熒光增強法測定蛋白質(zhì)的新方法。該納米粒由雙羥基萘酰亞胺化合物與PAA交聯(lián)而成，具有較長的熒光發(fā)射波長(>500 nm)和大的Stokes位移(～100 nm)，BSA能使其熒光顯著增加。在選定的實驗條件下，納米粒與BSA的反應5 min內(nèi)即完成，測定BSA的線性范圍為0.15～7.5 μmol·L-1，檢測限為0.095 μmol·L-1。該方法具有簡單、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，已成功用于 BSA合成樣品及牛奶樣品中蛋白質(zhì)的測定。