湯優(yōu)霞， 汪燕鳴， 孫登明*

(淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽淮北 235000)

黃芩苷(Baicalin)是從黃芩根中提取并分離出來的一種黃酮類化合物，它具有顯著的生物活性和抗炎、解痙、抑菌及利尿作用，并且還有相對較強的抗癌反應(yīng)等生理效能。黃芩苷在臨床醫(yī)學(xué)占有重要地位，主要用來治療肝炎。此外黃芩苷還能吸收紫外線，清除氧自由基，抑制黑色素的形成，也是一種功能性很好的美容化妝品原料。因此研究其準(zhǔn)確、簡單和高靈敏度的測定方法具有重要意義。近年來，測定黃岑苷常見的方法有高效液相色譜(HPLC)法[1]、毛細(xì)管電泳(CE)法[2]、近紅外(NIR)光譜法[3,4]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法[5,6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[7,8]等。黃岑苷具有良好的電化學(xué)活性[9]，但在未修飾電極上的過電位較大，靈敏度一般較低。化學(xué)修飾電極可減少過電位，提高測定的靈敏度和選擇性[10,11]，而通過金屬摻雜可進一步提高測定的靈敏度，并通過摻雜的金屬提高電極的導(dǎo)電性，減小背景電流等[12]。但摻雜的金屬在測定過程中由于電位的變化，可導(dǎo)致修飾在電極表面的金屬在測定過程中流失，影響測定的精密度和準(zhǔn)確度。

本研究將兩種具有催化活性的L-半胱氨酸和Ni通過分層修飾的方法，先將Ni修飾在電極表面，再將氨基酸聚合在Ni表面，制備了L-半胱氨酸和Ni分層修飾電極(PLC/Ni/GCE)。該修飾電極不僅保留了兩者的催化活性，且由于Ni表面聚合了一層氨基酸，使Ni在測定過程中不會因為測定電位的變化而脫落，提高了電極的穩(wěn)定性和測定的精密度。將該電極用于樣品中黃岑苷的測定，獲得了比較滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

BAS電化學(xué)分析系統(tǒng)(美國，BAS公司)；pHS-3C精密酸度計(上海康儀儀器有限公司)；Zennium電化學(xué)工作站(德國，Zahner公司)。研究用三電極系統(tǒng)：PLC/Ni/GCE或玻碳電極(GCE)為工作電極，鉑電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極。

黃岑苷(純度≥98%，上海純優(yōu)生物科技有限公司)溶液：5.0×10-3mol/L，使用時稀釋至實驗所需濃度，避光冷存；L-半胱氨酸溶液：5.0×10-3mol/L；Ni(NO3)2溶液：1.0×10-2mol/L；HNO3：1.5 mol/L；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=2.5～9.0)：用0.1 mol/L的NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、H3PO4溶液配制，在酸度計上校正。

1.2 L-半胱氨酸和Ni分層修飾電極的制備

將GCE按文獻方法[13]預(yù)處理后，放入10 mL含2.0 mL 0.010 mol/L Ni(NO3)2和3.5 mL 1.5 mol/L HNO3的溶液中，采用三電極系統(tǒng)，設(shè)置電位范圍為-0.4～-0.8 V，靜置30 s，以100 mV/s掃描速率，循環(huán)伏安(CV)法掃描6圈，取出，用水淋洗，濾紙吸干，即制得Ni修飾電極(Ni/GCE)。將該電極作為工作電極放入含5.0 mL 5.0×10-3mol/L L-半胱氨酸溶液和5.0 mL pH=4.0的PBS的聚合溶液中，用三電極系統(tǒng)，在-0.9～2.4 V電位范圍內(nèi)，靜置5 s，再以160 mV/s掃描速率，CV法掃描8圈，取出，用水淋洗，晾干，即制得L-半胱氨酸和Ni分層修飾電極(PLC/Ni/GCE)。

1.3 實驗方法

于10 mL容量瓶中，加一定量的黃岑苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，5.0 mL pH=2.5的PBS，用水稀釋至刻度，搖勻，轉(zhuǎn)移到電解池中，以PLC/Ni/GCE為工作電極，鉑電極為輔助電極，Ag/AgCl電極為參比電極，在-0.2～0.9 V的電位范圍內(nèi)，靜置90 s，利用差分脈沖伏安(DPV)法進行掃描，記錄峰電位和峰電流。每次掃描實驗結(jié)束后，把修飾電極放入到空白液中，掃至無峰，即可進行下一次實驗測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的最佳聚合條件

Ni修飾電極采用循環(huán)伏安沉積法，Ni(NO3)2用量和酸度、循環(huán)電位區(qū)間、掃描圈數(shù)、掃描速率都對黃岑苷的靈敏度、線性范圍有較大的影響。由于是將Ni沉積在電極表面，當(dāng)沉積條件改變時會影響沉積在電極表面Ni的性質(zhì)，影響Ni的催化效果。實驗結(jié)果表明，Ni修飾在電極表面的最佳實驗條件為：0.010 mol/L Ni(NO3)2的用量為2.0 mL，1.5 mol/L HNO3的用量為3.5 mL，掃描電位范圍為-0.8～-0.4 V，掃描速率為100 mV/s，掃描6圈，靜置時間為30 s。

分層修飾L-半胱氨酸時，聚合液的酸度、聚合電位區(qū)間、聚合圈數(shù)也影響測定黃岑苷的靈敏度和線性范圍。實驗結(jié)果表明，將Ni修飾電極放入含5.0 mL 5.0×10-3mol/L的L-半胱氨酸和5.0 mL pH=4.0 PBS的聚合液中，聚合電位為-0.9～2.4 V，掃描速率為160 mV/s，掃描8圈，靜置時間為5 s時，分層聚合修飾電極對黃岑苷的響應(yīng)電流最大。

2.2 修飾電極的表征

分別采用掃描電鏡(SEM)和電化學(xué)阻抗技術(shù)對修飾電極進行了表征。圖1是GCE、Ni/GCE和PLC/Ni/GCE的SEM圖，從第二幅圖可以看出，Ni均勻的修飾在電極表面，再將氨基酸修飾后，從第三幅圖看出電極表面相對較為光滑，但可以看出聚L-半胱氨酸薄膜內(nèi)部Ni顆粒的陰影，說明已按設(shè)計目標(biāo)成功地將兩者分層修飾在電極表面。

圖1 GCE、Ni/GCE和PLC/Ni/GCE的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of GCE，Ni/GCE and PLC/Ni/GCE

圖2中的曲線a和b分別表示GCE和PLC/Ni/GCE在0.1 mol/L[Fe(CN)6]3-/4-的含0.1 mol/L KCl溶液中的阻抗譜。從圖中可以清楚看出，PLC/Ni/GCE的Nyquist點是直線，說明電極表面是受擴散控制的，GCE有一個圓弧，這是由反應(yīng)動力學(xué)控制。同時，GCE的阻抗大于PLC/Ni/GCE的阻抗，這是因為Ni和L-半胱氨酸分層修飾所起到的效果決定的，同時說明電極分層修飾后增大了電子的傳遞速率。

2.3 黃岑苷在修飾電極上的電化學(xué)行為

2.3.1黃岑苷的循環(huán)伏安特性圖3表示濃度為5.0×10-5mol/L的黃岑苷在pH=2.5的PBS中，分別在GCE(1)、Ni/GCE(2)、PLC/GCE(3)和PLC/Ni/GCE(4)上的循環(huán)伏安圖。由圖3可知，在-0.4～1.0 V電位掃描區(qū)間，黃岑苷在GCE上相應(yīng)的峰電流較小，而在Ni/GCE、PLC/GCE和PLC/Ni/GCE上其對應(yīng)的峰電流較大。說明這三種修飾電極對黃岑苷都具有催化效果，且PLC/Ni/GCE的催化效果最好，氧化峰和還原峰的電流都達到最大值。在PLC/Ni/GCE上，黃岑苷的峰電位分別為Epa=0.498 V、Epc=0.414 V，△Ep=0.084 V。由此表明Ni和L-半胱氨酸分層修飾在GCE表面后，修飾電極對黃岑苷的催化作用和靈敏度得到了較大的增強。

圖2 GCE(a)和PLC/Ni/GCE(b)在0.1 mol/L[Fe(CN6)]3-/4-含0.1 mol/L KCl溶液中的Nyquist圖Fig.2 Nyquist impedance plots of the bare GCE(a) and PLC/Ni/GCE(b) in 0.1 mol/L[Fe(CN)6]3-/4- solution containing 0.1 mol/L KCl

圖3 黃岑苷在GCE(1)、Ni/GCE(2)、PLC/GCE(3)、和PLC/Ni/GCE(4)上的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of baicalin at GCE(1)，Ni/GCE(2)，PLC/GCE(3) and PLC/Ni/GCE(4) PBS：pH=2.5；scan rate：60 mV/s.

2.3.2底液酸度的影響圖4為改變底液酸度用CV法測得的結(jié)果，在pH=2.5～9.0的范圍內(nèi)，峰電位隨著pH值的增大向負(fù)方向移動，并且與pH呈線性關(guān)系：Epa(V)=0.6745-0.06513pH，R=0.9964，斜率為65 mV/pH，斜率接近0.59 mV/pH。由此可以說明，在修飾電極上黃岑苷發(fā)生等電子等質(zhì)子反應(yīng)過程。當(dāng)pH為2.5時，黃岑苷在PLC/Ni/GCE的響應(yīng)電流達到最大值。

圖4 (A)5.0×10-5 mol/L黃岑苷在PLC/Ni/GCE上隨pH值變化的循環(huán)伏安圖；(B)峰電位與pH值的關(guān)系曲線Fig.4 (A)Cyclic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L baicalin at PLC/Ni/GCE with various pH；(B)The corresponding relationship curve between the peak potential and pH pH：1-14：2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0.

圖5 (A)5.0×10-5 mol/L黃岑苷在不同掃速下的循環(huán)伏安圖；(B)lgIpa對lgv關(guān)系曲線Fig.5 (A)Cylic voltammograms of 5.0×10-5 mol/L baicalin at PLC/Ni/GCE with various scan rates;(B)The corresponding relationship curve between lgIpa and lgv scan rate:a-o：0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20，0.24，0.28，0.32，0.36，0.40 V/s.

2.3.3掃描速率對黃岑苷電化學(xué)行為的影響圖5為固定pH=2.5的PBS，僅改變掃描速率進行實驗的CV圖。從結(jié)果可知，在20～400 mV/s范圍內(nèi)，隨著掃描速率逐漸增大，黃岑苷在PLC/Ni/GCE上的響應(yīng)電流亦隨之增大；但可逆性也隨著掃描速率(v)的增大而變差。以lgI對lgv作圖，線性回歸方程為：lgIpa=-0.3522+0.9700lgv，r=0.9990，斜率值為0.9700，接近1。說明黃岑苷在PLC/Ni/GCE電極上的電化學(xué)行為受吸附控制。由吸附量公式[14]計算，在掃速為60 mV/s，pH=2.5底液中，對5.0×10-5mol/L 黃岑苷進行測定，得出黃岑苷在電極表面吸附量Γ為4.31×10-9mol/cm2。

掃速在100～400 mV/s范圍內(nèi)，Epa與lnv呈線性關(guān)系，線性方程為：Epa=0.1045+0.0721lnv，R=0.9908。根據(jù)文獻報道[15]，E～lnv方程中的斜率等于RT/anF。其中，電子傳遞系數(shù)a一般取理論值0.5，n為得失電子數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，求得黃岑苷參與電極反應(yīng)的實際得失電子數(shù)為0.71，接近1。

2.4 差分脈沖法測定黃岑苷的最佳條件

采用差分脈沖伏安(DPV)法對5.0×10-5mol/L的黃岑苷進行測定，實驗結(jié)果表明，靜置時間對黃岑苷的峰電流影響較大，隨著靜置時間的增大，峰電流也逐漸增大，當(dāng)靜置時間為90 s時，峰電流達到最大，之后趨于穩(wěn)定，故選擇靜置時間為90 s。

采用DPV法對黃岑苷進行測定。儀器參數(shù)設(shè)置如下，掃速:60 mV/s;電位增量:0.006 V;脈沖振幅:0.05 V;脈沖寬度:0.06 s;脈沖間隔:0.2 s；靜置時間:90 s。

2.5 黃岑苷工作曲線、檢出限、精密度和穩(wěn)定性

采用DPV法對黃岑苷進行測定，結(jié)果見表1。由表1可知，PLC/Ni/GCE有較好的靈敏度和較寬的線性范圍。用PLC/Ni/GCE對5.0×10-5mol/L 黃岑苷進行20次平行實驗，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%。表明PLC/Ni/GCE對黃岑苷的測定具有良好的精密度。黃岑苷測定的峰電位和峰電流分別為：E1=0.498 V，Ipa1=-20.44 μA，PLC/Ni/GCE在室溫下放置20 d，再次測定時，峰電位和峰電流分別為E2=0.497 V，Ipa2=-20.46 μA：說明PLC/Ni/GCE具有良好的穩(wěn)定性。

表1 PLC/Ni/GCE測定黃岑苷的結(jié)果

2.6 干擾實驗

2.7 樣品分析

取樣品柴黃片，研碎后稱取一定量，用0.1 mol/L NaOH溶液加熱溶解后，用PBS調(diào)節(jié)酸度，移至100 mL容量瓶中定容，按實驗方法取一定量的樣品溶液進行測定，分析結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中黃岑苷的分析結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本實驗制備了L-半胱氨酸和鎳分層修飾電極，通過考察黃岑苷在該修飾電極上的電化學(xué)行為，證明了該電極對黃岑苷有較強的催化作用，檢測的靈敏度和精密度高，且電極穩(wěn)定性好，有較好的應(yīng)用前景。