陳衛(wèi)豐

[摘要] 目的 探討局部44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣的效果及對外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞）及相關(guān)因子的影響，以研究其在尖銳濕疣發(fā)病機制中的作用。 方法 選取2013年1月～2015年4月益陽市中心醫(yī)院皮膚科門診就診的尖銳濕疣患者35例（CA組），正常者35例作為對照組，CA組應(yīng)用局部44℃溫?zé)嶂委煟?個月后評價療效并測定治療前后外周血血清中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞和相關(guān)因子水平，并與對照組進(jìn)行比較分析。 結(jié)果 CA組患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比及CD4+CD25+T細(xì)胞表面抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達(dá)均明顯高于對照組（t = 9.52、15.07、8.63、9.16、10.92，均P < 0.05）；胞內(nèi)IL-10和TGF-β陽性細(xì)胞百分比較對照組增多（t = 3.22，7.02，均P < 0.05）；CA組治療3個月，總有效率為85.71%（30/35），治療中未見明顯副作用。外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞百分比、CTLA-4、GITR、PD-L水平及IL-10、TGF-β陽性細(xì)胞百分比均較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 7.76、12.91、7.46、7.68、9.29、2.64、6.01，均P < 0.05）。 結(jié)論 HPV感染可活化增殖CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，其高表達(dá)協(xié)同刺激分子和抑制性細(xì)胞因子，溫?zé)嶂委熂怃J濕疣安全有效，其治療機制可能與調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及相關(guān)因子有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 44℃溫?zé)?；尖銳濕疣；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

[中圖分類號] R752.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（b）-0107-04

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）對機體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能方面起非常重要的作用，如維持免疫自穩(wěn)、調(diào)控免疫應(yīng)答等。研究表明，由人類乳頭瘤病毒（HPV）引起的尖銳濕疣（CA）與其細(xì)胞免疫功能相對不足密切相關(guān)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞調(diào)控機體對病毒感染的免疫應(yīng)答主要通過抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞因子分泌，CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞的局部聚集可能是皮損的CA實現(xiàn)免疫逃逸的機制之一[1]。近年來，局部的44℃溫?zé)嶂委煴怀晒Φ貞?yīng)用于不同型別的HPV感染，可能通過促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞（LC）的遷移和成熟，在局部細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[2]。本研究通過動態(tài)檢測35例CA患者在44℃溫?zé)嶂委熐昂驝D4+CD25+Treg的表達(dá)及在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化發(fā)育和功能維持中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3以及負(fù)性協(xié)同刺激分子，如程序性死亡分子配體（PD-L）、細(xì)胞毒T細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）和腫瘤壞死因子受體（GITR）等的表達(dá)水平，以及CD4+CD25+Treg細(xì)胞內(nèi)分泌的抑制性細(xì)胞因子白介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的陽性細(xì)胞百分比，探討44℃溫?zé)釋A患者機體免疫功能的影響及可能作用機制，為溫?zé)嶂委熂怃J濕疣提供新的理論依據(jù)和新的治療靶點。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2013年1月～2015年4月益陽市中心醫(yī)院皮膚科門診就診的經(jīng)臨床確診的CA患者35例，均無復(fù)發(fā)性CA病史，35例受試者疣體數(shù)目≥5個或單個直徑≥2 cm，符合2000年原衛(wèi)生部防疫司制訂的CA診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，其中男15例，女20例；年齡18～60歲，平均（37.45±10.58）歲；病程0.1～30個月，平均（9.63±3.51）個月。選取正常人作為對照組，共35例，其中男17例，女18例，年齡18～58歲，平均（30.78±9.41）歲。所有研究對象近2個月內(nèi)沒有使用過任何免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)藥物，排除全身衰竭、結(jié)核、肝腎疾病、腫瘤、器官移植及其他免疫性疾病。各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)其本人或家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法

應(yīng)用中國醫(yī)科大學(xué)自主研制的溫?zé)嶂委焹x（專利號ZL200720185403.3），選取靶疣進(jìn)行局部44℃溫?zé)嶂委?，連續(xù)治療4 d，每次60 min，1 次/d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療3 d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療2 d；此后每隔7～10 d進(jìn)行1次治療，直至疣體消退。3個月時觀察臨床療效。

1.3 研究方法

1.3.1試劑和儀器 CD4-FITC單克隆鼠抗人抗體，CD25-PE單克隆鼠抗人抗體及同型對照IgG1-FITC，IgG1-PE，PD-L-FITC單克隆鼠抗人抗體、CTLA-4（CD152）-PE單克隆鼠抗人抗體及同型對照小鼠IgG1、IgG2α抗體和PE標(biāo)記的抗人Foxp3胞內(nèi)染色試劑盒均購自eBioscience公司。流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品（型號：EPICS-XL）。人IL-10、人TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒為eBiosource公司產(chǎn)品。淋巴細(xì)胞分離液（AXIS-SHIELD公司）。MagCellectTM人CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購自R&D公司。

1.3.2 CD4+CD25+T細(xì)胞的分離純化 用90 μL緩沖液調(diào)整外周血單個核細(xì)胞（PBMC）為1×108/mL，再加入CD25磁珠標(biāo)記抗人CD25單抗10 μL，置4℃冰箱孵育15 min，過MS柱分選，收集流下來的細(xì)胞懸液和洗柱液，陽性選擇獲得CD4+CD25+Treg細(xì)胞，重復(fù)上述操作，以增加細(xì)胞的純度。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，其純度>85%。

1.3.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞染色 采用淋巴細(xì)胞分離液（AXIS-SHIELD公司）經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，用含10%的小牛血清的培養(yǎng)基RPMI 1640調(diào)細(xì)胞至1×106/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入抗CD4-PE、CD25-FITC單克隆抗體各20 μL，同型對照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻，室溫避光孵育20～30 min，加2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，4℃，1500 r/min離心5 min，棄上清，加2%正常大鼠血清100 μL，避光封閉20 min，以減少非特異性熒光吸附，再加入PE標(biāo)記抗人Foxp3抗體10 μL，避光孵育20～30 min，加2 mL PBS緩沖液洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于0.5 mL PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測。

1.3.4 CD4+CD25+Treg細(xì)胞膜分子熒光染色 采用全血熒光抗體直接染色法[3]，取2管EDTA抗凝全血100 μL，置12 mm×75 mm專用塑料試管中，加入20 μL特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗作為同型對照，室溫下避光染色15 min。然后加入溶血素2 mL溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞，靜置5 min，4℃，1500 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次，最后加入1%多聚甲醛300 μL固定后上機檢測。

1.3.5 CD4+CD25+Treg細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的檢測 具體方法參見文獻(xiàn)[4]：取上述凍存PBMC培養(yǎng)上清，采用ELISA法檢測上清中IL-10和TGF-β水平，按試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。

1.4 療效標(biāo)準(zhǔn)

治愈：外陰尖銳濕疣疣體全部脫落，臨床癥狀消失，宮頸HPV-DNA復(fù)查結(jié)果為陰性。顯效：宮頸HPV-DNA復(fù)查結(jié)果為陰性或弱陽性，外陰尖銳濕疣疣體脫落70%以上。無效：HPV-DNA復(fù)查結(jié)果為陽性或強陽性，外陰尖銳濕疣疣體無改變或無明顯脫落?？傆行?（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。以3個月為治療終點，計算總有效率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

CA患者經(jīng)局部44℃溫?zé)嶂委?個月后，總有效率達(dá)85.71%（30/35），治療中未見明顯副作用。

2.1 兩組外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞、抑制性膜分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較

CA組患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達(dá)水平均顯著高于對照組（均P < 0.05）；CA組患者IL-10及TGF-β的陽性細(xì)胞數(shù)比對照組明顯增多（均P < 0.05）。見表1。

2.2治療前后CA患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞、抑制性膜分子和細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

治療后外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞、CTLA-4、GITR、PD-L水平及IL-10、TGF-β陽性細(xì)胞數(shù)較治療前顯著下降（均P < 0.05）。見表2。

3 討論

大量研究表明，免疫系統(tǒng)在人乳頭瘤病毒引起的相關(guān)疾病結(jié)局上起重要作用，HPV持續(xù)感染的重要機制是全身或局部細(xì)胞免疫功能缺陷，病損局部主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ和MHCⅡ分子的下調(diào)，導(dǎo)致惡性變[1-4]。近年隨著對CD4+CD25+Treg各種生物學(xué)特性和功能的進(jìn)一步研究，CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面表達(dá)CD25、CTLA-4、GITR和PD-L等膜分子，其特征性的分子標(biāo)記是Foxp3+，發(fā)現(xiàn)HPV感染很可能存在Treg異常，如HPV病損局部可有CD4+CD25+Foxp3+ Treg高表達(dá)，也不具有MHC限制性，主要通過細(xì)胞間直接接觸和分泌抑制性膜分子IL-10和TGF-β發(fā)揮免疫抑制功能，免疫抑制環(huán)境主要由局部低表達(dá)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TGF-β、IL-10高表達(dá)形成。CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一種新型免疫抑制調(diào)節(jié)細(xì)胞，機體對病毒感染的免疫應(yīng)答主要通過抑制增殖效應(yīng)細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子來調(diào)控，CD4+CD25+Treg細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)可能在CA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5]，提示刺激HPV發(fā)生特異性免疫反應(yīng)可通過抑制或去除Treg細(xì)胞來達(dá)成，從而抑制HPV的持續(xù)慢性感染。隨著熱療技術(shù)的相關(guān)原理研究進(jìn)一步深入，以及對溫度測定、控制和加熱技術(shù)的不斷進(jìn)步，熱療技術(shù)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，溫?zé)岜粡V泛應(yīng)用于各種病毒疣的治療，并且取得了良好的療效，但其具體的作用機制尚不明了[6-7]。有研究表明，44℃溫?zé)崮軌虼龠M(jìn)LC成熟、遷移，并且增強其抗原提呈能力，LC能通過真皮層向局部淋巴結(jié)遷移，誘導(dǎo)病毒疣局部細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，從而對病毒感染引起的病毒疣發(fā)揮有效作用[8-9]。

本研究結(jié)果表明，CA患者CD4+CD25+ Treg細(xì)胞、轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L表達(dá)均比對照組顯著增高（P < 0.05）；CA組CD4+CD25+T細(xì)胞內(nèi)分泌IL-10及TGF-β的陽性細(xì)胞數(shù)比對照組明顯增多，說明機體免疫功能受到明顯抑制，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及相關(guān)因子共同參與了尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展，CA患者高表達(dá)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)，可誘導(dǎo)其增殖活化，同時高表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制信號的負(fù)性協(xié)同刺激分子CTLA-4、GITR及PD-L，其表達(dá)水平可以反映Treg細(xì)胞功能的強弱，通過某種機制抑制機體免疫功能的影響，這在尖銳濕疣發(fā)病機制中起重要作用[10]。也有學(xué)者指出，Treg細(xì)胞可以通過直接接觸和分泌抑制性因子IL-10及TGF-β發(fā)揮免疫抑制和感染耐受的雙重作用[11]。尖銳濕疣發(fā)生及持續(xù)感染的重要機制之一在于機體不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用[12]，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞通過抑制CD4+和CD8+細(xì)胞的IL-2基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)來抑制T細(xì)胞的活化增殖，使局部微環(huán)境處于免疫抑制或耐受狀態(tài)，F(xiàn)oxp3+Treg細(xì)胞通過TGF-β在促進(jìn)自身增殖分化同時抑制Th1和Th2分化，從反向抑制了機體局部抗病毒免疫應(yīng)答[13]，形成尖銳濕疣持續(xù)感染，促進(jìn)了尖銳濕疣生長和發(fā)展。有研究表明，CA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞含量明顯增高，且復(fù)發(fā)患者顯著高于初發(fā)患者，提示尖銳濕疣患者存在有一定程度上病毒特異性細(xì)胞免疫受損，而細(xì)胞免疫功能水平直接影響尖銳濕疣HPV感染的病程及其疾病的轉(zhuǎn)歸，通過抑制或去除Treg細(xì)胞來刺激HPV特異性免疫反應(yīng)，從而抑制HPV慢性感染[14]。局部44℃溫?zé)嶂委?個月，治愈率達(dá)85.71%，治療中未見明顯副作用，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量、CTLA-4、GITR、PD-L、IL-10和TGF-β水平顯著下降（P < 0.05），表明溫?zé)崮軌蛴行е委烪PV感染尖銳濕疣病，這可能與協(xié)助增強機體免疫功能有關(guān)。溫?zé)嶂委燄囿w的說法不一，有些研究者認(rèn)為病灶組織與正常組織相比，對溫?zé)岣舾衃15]，熱損傷后更不易恢復(fù)[16]，有些則推測可能是溫?zé)嵋鸩∽兘M織壞死。研究發(fā)現(xiàn)，44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣病后，機體可抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞增殖活化，負(fù)性調(diào)節(jié)刺激分子CTLA-4、GITR、PD-L以及抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β，推測其機制可能為促進(jìn)了局部免疫調(diào)節(jié)作用，引起靶疣局部LC向附近淋巴結(jié)遷移和增強抗原提呈功能，從而促成特異性免疫應(yīng)答的建立，破除由局部高表達(dá)IL-10和TGF-β形成的免疫抑制環(huán)境，抑制免疫逃逸機制以清除HPV病毒[2，17]。

綜上所述，本研究認(rèn)為，44℃溫?zé)嶂委熂怃J濕疣具有較好的臨床療效，能有效調(diào)節(jié)機體的免疫功能，其治療機制可能與調(diào)節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及相關(guān)分子有關(guān)，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2015-04-14 本文編輯：任 念）