李兆永, 王鳳美, 牛增元* , 羅 忻, 陳軍輝, 王小如

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島 266002；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心，山東青島 266061)

鄰苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters,PAEs)是一類應(yīng)用廣泛的塑料添加劑，常作為溶劑和定香劑被添加到化妝品中，以增加產(chǎn)品的柔韌性并保持其香味持久不易揮發(fā)[1]。PAEs是國(guó)際上重點(diǎn)監(jiān)控的內(nèi)分泌干擾物，這類物質(zhì)損害人類的生殖系統(tǒng)，影響生物體內(nèi)激素的正常分泌，導(dǎo)致細(xì)胞突變，致畸和致癌[2]。歐盟化妝品新法規(guī)[3]和我國(guó)《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》[4]均明文規(guī)定多種PAEs化合物為禁用物質(zhì)。因此，建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)化妝品中PAEs的方法，對(duì)人類健康和化妝品行業(yè)秩序的規(guī)范都有重要的意義。

目前有關(guān)PAEs的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6 - 8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9 - 12]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13 - 16]等。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因其特異性好，靈敏度高等特點(diǎn)而發(fā)展為PAEs分析的主要方法。黃琦君等[13]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)現(xiàn)了水溶性化妝品中10種PAEs的同時(shí)測(cè)定；Xu等[15]應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了食品中多種PAEs的測(cè)定方法。但這些方法均是使用低分辨質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行的PAEs分析檢測(cè)，有可能將含量比較高的雜質(zhì)誤認(rèn)為是待測(cè)化合物從而產(chǎn)生定量和定性方面的偏差，并且對(duì)沒有標(biāo)準(zhǔn)品的未知化合物的篩選鑒別有一定的局限性。由于化妝品種類繁多且基質(zhì)復(fù)雜，需要采用具有更高靈敏度的和更強(qiáng)抗基質(zhì)干擾的先進(jìn)方法。線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(LTQ/Orbitrap MS)兼有離子阱和高分辨質(zhì)譜平行檢測(cè)的能力，離子阱的多級(jí)質(zhì)譜功能可獲得碎片信息，高分辨質(zhì)譜可獲得精確質(zhì)量數(shù)，可以彌補(bǔ)低分辨質(zhì)譜技術(shù)的不足，適用于復(fù)雜基質(zhì)中化合物的快速篩選和鑒別分析[17]。目前，LTQ/Orbitrap技術(shù)已先后應(yīng)用于生物[18]、食品[19]和紡織品[20]等領(lǐng)域。本課題組在前期研究中采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS實(shí)現(xiàn)了紡織品中致癌染料的篩查和確證[21]，而LTQ/Orbitrap技術(shù)用于快速鑒定化妝品中PAEs的研究尚未見報(bào)道。本研究采用超高效液相色譜(UPLC)-LTQ/Orbitrap MS技術(shù)，建立基于化合物精確質(zhì)量數(shù)篩選的化妝品中PAEs的快速鑒別方法，為保障化妝品安全，規(guī)范化妝品行業(yè)秩序提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)；Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL 組合式高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)，ThermoFisher公司)；Himac CR22GII高速冷凍離心機(jī)(日本，日立公司)；MS1Minishaker旋渦混合器(德國(guó)，IKA公司)；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司)；FA1104型電子天平(上海精天電子儀器廠)。

鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二正戊酯(DPP)及鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司(純度均≥99%)。 分別準(zhǔn)確稱取PAEs標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存。臨用時(shí)根據(jù)需要逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。甲醇，乙腈(美國(guó)Burdick & Jackson公司)和甲酸(美國(guó)Fluka公司)均為色譜純。超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore)制得。

1.2 樣品的處理

為避免干擾，實(shí)驗(yàn)均采用玻璃容器?；瘖y品樣品按不同類型分別進(jìn)行前處理。

1.2.1水劑樣品準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋3 min，超聲提取15 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.2膏體、乳劑樣品準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋3 min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心5 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3油劑樣品準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋3 min，超聲提取15 min后加入10 mL正己烷，渦旋混勻，靜置分層，棄去正己烷層，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100×2.1 mm,1.7 μm)；流速:0.25 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫:30 ℃；流動(dòng)相A為水(含5 mmol/L乙酸銨和0.1%(V/V)甲酸)，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min，20%～30%B；5～7.5 min，30%～55%B；7.5～15 min，55%～95%B；15～20 min，95%B；20～20.1 min，95%～20%B。

1.3.2質(zhì)譜條件可加熱的電噴霧離子源(HESI)；質(zhì)量分析器:FT Orbitrap；離子化方式:ESI+；毛細(xì)管溫度:350 ℃；噴霧電壓:3.0 kV；管狀透鏡電壓:80 V；鞘氣(N2)壓力:2.067×105Pa；輔助氣(N2)流量:200 L/h；質(zhì)量范圍(m/z):100～1 000。采用平行模式掃描：靜電場(chǎng)軌道阱高分辨掃描(分辨率R=30 000)，再對(duì)其中響應(yīng)較強(qiáng)的二級(jí)碎片離子進(jìn)行線性離子阱掃描；歸一化能量:35%。14種PAEs化合物的UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析參數(shù)見表1。

表1 14種PAEs化合物的分析參數(shù)

(續(xù)表1)

No.CompoundFormulaRetention time(min)Ion formation[M+H]+Measured (m/z)Mass accuracy error(10-6)Fragment ion2DMEPC14H18O67.45[M+H]+283.11761283.11668-3.28207.064143DEEPC16H22O68.97[M+H]+311.14891311.14804-2.80221.079894DEHPC24H38O417.41[M+H]+391.28429391.28354-1.92149.022835DNOPC24H38O417.92[M+H]+391.28429391.28404-0.64149.022786BMPPC20H30O414.97[M+H]+335.22169335.22088-2.42251.126907DHXPC20H30O415.32[M+H]+335.22169335.22068-3.01149.022818DPhPC20H14O411.40[M+H]+319.09649319.096500.03225.054349DBPC16H22O412.25[M+H]+279.15909279.159330.86149.02300,205.0858210DIBPC16H22O417.41[M+H]+279.15909279.159180.32149.02307,205.0857811DPrPC14H18O414.97[M+H]+251.12779251.12714-2.59191.06981,149.0228812DCHPC20H26O414.18[M+H]+331.19039331.190791.21149.02301,249.1121613DEPC12H14O49.02[M+H]+223.09649223.09646-0.13177.0544814DPPC18H26O414.02[M+H]+307.19039307.18955-2.73149.02263,219.10075

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取

對(duì)化妝品中PAEs化合物的提取國(guó)內(nèi)外研究較多。因PAEs難溶于水，較易溶于有機(jī)溶劑，多數(shù)文獻(xiàn)中均采用有機(jī)溶劑提取。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用加標(biāo)回收的方法分別用不同的溶劑(甲醇、乙腈、甲醇水50%(V/V)、乙腈水50%(V/V)、乙酸乙酯、丙酮)，在不同的超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)，針對(duì)不同劑型的化妝品樣品進(jìn)行了提取，以考察提取效果。通過對(duì)比回收率結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以甲醇為提取溶劑，超聲提取15 min時(shí)的提取效果最好。

2.2 色譜/質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 14種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)品提取總離子流色譜圖Fig.1 Extracted total ion current chromatograms of 14 PAEs standards

PAEs常溫下呈無色粘稠狀液體，難溶于水而易溶于有機(jī)溶劑，適合在反相色譜柱上分離。采用反相色譜柱分離PAEs的研究已有報(bào)道[8,15]。本研究使用14種常見PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離條件的優(yōu)化。首先，以水(含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相，比較了C8和C18兩種色譜柱對(duì)14種PAEs成分的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18柱對(duì)14種標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果較好。對(duì)比不同生產(chǎn)廠家的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)不同廠家的C18柱對(duì)PAEs的分離選擇性差異不大，本研究所用的ACQUITY UPLC BEH C18柱采用1.7 μm顆粒度的柱填料能大幅提升色譜柱的性能，從而獲得更高的柱效；其次，對(duì)流動(dòng)相的組成，流動(dòng)相中乙酸銨和甲酸的濃度、流速等條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，在最佳分離條件下，所有PAEs化合物包括同分異構(gòu)體之間均能達(dá)到基線分離，14種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離結(jié)果見圖1(進(jìn)樣量10 μL)，完全能滿足UPLC-LTQ/Orbitrap MS快速篩查化妝品中多種PAEs化合物的檢測(cè)要求，并且峰形良好，基質(zhì)干擾影響小。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PAEs類化合物在ESI+下發(fā)生電離通常產(chǎn)生[M+H]+峰。本研究對(duì)14種PAEs化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得最佳的靈敏度。首先分別采用正負(fù)模式全掃描對(duì)14種PAEs標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種化合物只在ESI+條件下有響應(yīng)，且產(chǎn)生[M+H]+峰。因此，本研究采用正離子模式全掃描檢測(cè)對(duì)化妝品提取物中的PAEs進(jìn)行篩選，在最佳質(zhì)譜條件下對(duì)14種PAEs標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)定的各化合物準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差均小于5.0×10-6,完全能滿足基于精確質(zhì)量數(shù)篩查的分析要求。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1線性關(guān)系及檢出限高分辨質(zhì)譜提取的是精確質(zhì)量數(shù)，提取色譜圖噪音幾乎可以忽略，以信噪比(S/N)計(jì)算的檢出限和定量限與方法的真實(shí)性能可能存在差距。因此，本實(shí)驗(yàn)用空白基質(zhì)(以乳膏類樣品基質(zhì)為例)提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度，換算為方法的檢出限，以消除基質(zhì)干擾的影響。將14種PAEs化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液用基質(zhì)空白提取液稀釋成合適濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以化合物濃度和峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各化合物的線性范圍和檢出限等見表2。

表2 14種PAEs化合物線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3.2回收率采用水劑、乳液和油劑空白化妝品樣品中分別添加低、中、高3個(gè)水平(DPhP和DEP為0.5 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg；DNOP和DHXP為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、1 mg/kg；其余均為0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加入回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明14種PAEs的平均回收率為70.8%～111.6%，RSD為1.5%～9.7%。在最佳儀器條件下，14種PAEs的儀器檢出限在0.05～0.5 mg/kg范圍內(nèi)，雖然較XU等[15]采用三重四極桿質(zhì)譜的靈敏度差，但是完全能滿足化妝品實(shí)際樣品中PAEs的快速篩選鑒別要求。

表3 空白化妝品中14種PAEs化合物的添加回收率(n=6)

3 化妝品中PAEs精確質(zhì)量數(shù)快速篩查和鑒別

對(duì)于化妝品中的PAEs的分析，低分辨質(zhì)譜法由于檢測(cè)質(zhì)量精度低，無法排除雜質(zhì)的干擾，可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。而高分辨質(zhì)譜能提供化合物精確質(zhì)量數(shù)，并且可通過保留時(shí)間和二級(jí)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)確認(rèn)，大大降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)率，從而顯著提高方法的選擇性。本實(shí)驗(yàn)通過準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)UPLC-LTQ Orbitrap MS分析得到的一級(jí)全掃描總離子流圖進(jìn)行各化合物信號(hào)提取，以實(shí)現(xiàn)化妝品提取物中各種PAEs的快速篩選。Orbitrap靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap MS)是一種新興的高分辨質(zhì)譜技術(shù)，可以提供較高的選擇性并且可以在全掃描模式下以較小的質(zhì)量窗口提取離子。小的質(zhì)量窗口可以顯著減小背景噪音、提高信噪比，并且降低了錯(cuò)誤結(jié)果的發(fā)生[22]。下面以用本研究建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)到的一種精油類化妝品中的DEP為例，介紹篩選及鑒別的過程。

圖2 樣品中DEP的提取離子色譜圖(a)、一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖(b)、二級(jí)CID質(zhì)譜圖(c)和標(biāo)準(zhǔn)溶液中DEP的二級(jí)CID質(zhì)譜圖(d)Fig.2 Extracted ion chromatogram(a),full-scan accurate mass spectrum(b),CID mass spectrum of DEP in a sample(c) and CID mass spectrum of DEP in standard solution(d)

香薰精油化妝品提取液采用UPLC-LTQ/Orbitrap MS進(jìn)行分析，獲得ESI+總離子流圖，然后通過DEP的準(zhǔn)分子離子的精確質(zhì)量數(shù)對(duì)一級(jí)全掃描總離子流圖進(jìn)行信號(hào)提取，離子提取窗口寬度為5.0×10-6，通過信號(hào)提取得到圖2a，圖2a中有一個(gè)明顯的提取離子色譜峰，保留時(shí)間為9.01 min，對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖2b，可以看出圖2b中有明顯的m/z223.09702的[M+H]+峰，實(shí)測(cè)值與理論值相比，精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差為2.38×10-6，符合歐盟相關(guān)法規(guī)[23]對(duì)高分辨質(zhì)譜定性確認(rèn)的精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差要求(<5.0×10-6)。由此可見，通過高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)信息篩選，可滿足對(duì)化妝品中PAEs快速篩查及鑒別的分析要求。對(duì)疑似陽(yáng)性樣品，除了通過精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間篩選外，還可根據(jù)二級(jí)碎片離子進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)溶液的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖2c)和實(shí)測(cè)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖2d)，發(fā)現(xiàn)各碎片離子以及離子相對(duì)豐度也基本一致，且各主要碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差也在5 .0×10-6以內(nèi)。參照歐盟2002/657/EC[24]中對(duì)質(zhì)譜定性的相關(guān)規(guī)定：高分辨質(zhì)譜母離子可獲得的識(shí)別點(diǎn)數(shù)是2.0，高分辨質(zhì)譜子離子可獲得的識(shí)別點(diǎn)數(shù)是2.5，而通過采用DEP的一級(jí)母離子和二級(jí)CID碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行樣品定性，可獲得大于7個(gè)識(shí)別點(diǎn)的定性分?jǐn)?shù)，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了歐盟2002/657/EC對(duì)禁用藥物確認(rèn)需要最少4個(gè)識(shí)別點(diǎn)的規(guī)定。因此，通過保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)即可對(duì)PAEs化合物進(jìn)行快速篩查。篩查出的陽(yáng)性樣品再經(jīng)離子阱的二級(jí)譜圖掃描，通過二級(jí)特征碎片離子進(jìn)行定性確證。

運(yùn)用本研究建立的UPLC-LTQ Orbitrap MS高分辨質(zhì)譜法結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)篩選，對(duì)進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)的香水類、霜膏類、精油類等不同類型的化妝品樣品共50份進(jìn)行了分析測(cè)定，并采用保留時(shí)間比對(duì)和離子阱的多級(jí)質(zhì)譜分析進(jìn)行了定性確認(rèn)。結(jié)果顯示：在1種霜膏類樣品和2種精油類樣品中含有DEP；3種霜膏類樣品中含有DIBP和DBP；1種霜膏類樣品和1種精油類樣品中含有DEHP。由以上結(jié)果可以看出，本研究建立的基于精確質(zhì)量數(shù)篩選的UPLC-LTQ Orbitrap MS高分辨質(zhì)譜法是快速鑒別化妝品中PAEs的有效方法。

4 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證化妝品中PAEs的方法，方法的回收率、檢出限和精密度等各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。方法簡(jiǎn)便、快速，選擇性高，抗干擾性較好，定性結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠滿足化妝品中PAEs的快速篩選鑒別需要。