王　吉， 衛(wèi)　禮， 付　瑞， 李曉波， 王淑菁， 邢　進(jìn)， 馮育芳， 鞏　薇， 岳秉飛， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所、國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心， 北京 100050）

長爪沙鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

王吉， 衛(wèi)禮， 付瑞， 李曉波， 王淑菁， 邢進(jìn)， 馮育芳， 鞏薇， 岳秉飛， 賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所、國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測(cè)中心， 北京 100050）

目的 建立長爪沙鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）抗體ELISA檢測(cè)方法， 應(yīng)用于長爪沙鼠攜帶LCMV的檢測(cè)。方法 培養(yǎng)Vero細(xì)胞，接種LCMV毒種，制備Vero正常抗原和LCMV特異抗原，滴定酶結(jié)合物、正?？乖疤禺惪乖罴压ぷ鳚舛龋⑦M(jìn)行方法的特異度、靈敏度、精密性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 正?？乖?、特異抗原和酶結(jié)合物最佳工作濃度分別為0.4 μg/mL、10 μg/mL和1∶5 000； 正常抗原、特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)分別為6.8%和8.9%，批間平均變異系數(shù)分別為9.3%和8.4%； 檢測(cè)靈敏度達(dá)到1∶1 280； 與小鼠仙臺(tái)病毒（SV）、小鼠呼腸孤病毒3型（Reo3）均無交叉反應(yīng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)偏差小于25%。結(jié)論 建立的ELISA方法特異度、靈敏度強(qiáng)，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于長爪沙鼠LCMV抗體的檢測(cè)。

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）； ELISA； 長爪沙鼠

長爪沙鼠又稱蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus；Mongolian gerbil），分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬，產(chǎn)于我國內(nèi)蒙、河北、山西、甘肅等地，是一種正在開發(fā)、有著廣闊應(yīng)用前景的多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［1-5］。國內(nèi)外大量研究資料表明，長爪沙鼠具有多方面獨(dú)特的生物學(xué)特性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、行為學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域［1-5］，而且由于長爪沙鼠的乳鼠對(duì)流行性出血熱病毒的易感性，一直用作流行性出血熱疫苗的研究及生產(chǎn)［2，4，5］。應(yīng)賢平等［6］和段明麗等［7］經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)屏障系統(tǒng)長爪沙鼠、開放飼養(yǎng)的長爪沙鼠和野生長爪沙鼠對(duì)淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒均易感。

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）屬于沙粒病毒科（Arenaviridae），沙粒病毒屬（Arenavirus）。是一種由鼠類攜帶的人獸共患病毒，自然儲(chǔ)存宿主主要有小鼠和地鼠［8-11］。大鼠、豚鼠、倉鼠、犬、猴、雞、馬、兔和棉鼠均易感［8］。LCMV在全球分布廣泛，在北美、南美、亞洲和歐洲均有流行的報(bào)道。我國也有LCMV感染人和鼠的報(bào)道［8］。動(dòng)物感染臨床主要表現(xiàn)精神呆滯、嗜睡、被毛粗亂、弓背、消瘦、生長緩慢、驚厥和結(jié)膜炎等癥狀，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)，而且會(huì)給飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員帶來潛在感染的危險(xiǎn)［8，12-14］。人類主要由于接觸攜帶病毒的鼠類排泄物而引起感染，臨床主要表現(xiàn)流感樣癥狀和腦膜炎，嚴(yán)重者會(huì)留下神經(jīng)后遺癥甚至死亡［8，12-14］。

本文旨在建立長爪沙鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗體ELISA方法，為保證長爪沙鼠的安全使用及標(biāo)準(zhǔn)化研究提供檢測(cè)技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1主要材料

LCMV毒種、Vero細(xì)胞： 本室凍存； 兔抗沙鼠IgG-HRP： GeneTex公司產(chǎn)品； 長爪沙鼠LCMV、仙臺(tái)病毒（SV）、呼腸孤病毒3型（Reo3）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）標(biāo)準(zhǔn)陰、陽對(duì)照血清：浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心提供；63 只開放環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠，20只經(jīng)凈化屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)的長爪沙鼠，均來源于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［SCXK（京）2013-0006］； 22只開放環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠，來源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（浙）2014-0001］。所有實(shí)驗(yàn)用的動(dòng)物均按3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2主要儀器

酶標(biāo)儀： ThermoMULTISKAN MK3； 37 ℃水浴箱： 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 DK-4500B型； 37 ℃培養(yǎng)箱： WGP-600。

1.3方法

1.3.1病毒感染力滴度（TCID50）測(cè)定將LCMV病毒液以10-1～10-11作系列倍比稀釋，依次加入培養(yǎng)有Vero細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（costor）（1～11列）， 每個(gè)稀釋度接種1列（8孔）， 第12列不加病毒， 作為細(xì)胞對(duì)照。置37 ℃培養(yǎng)觀察10 d， 記錄結(jié)果［5，15-17］。

1.3.2抗原的制備及純化正?？乖?Vero細(xì)胞長滿單層， 常規(guī)消化， 用PBS洗滌， 4 ℃ 1 000 r/min離心10 min， 將離心沉淀溶于適量PBS 凍融3次后，超聲破碎，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min， 取上清，測(cè)定蛋白含量［5，15-17］。

特異抗原： 收獲LCMV細(xì)胞毒于4 ℃， 10 000 r/min離心1 h， 取上清于4 ℃， 40 000 r/min離心3 h， 收集沉淀于適量PBS中［5，15-17］。再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%蔗糖離心后， 用紫外分光光度法測(cè)定抗原蛋白含量［5，15-17］。

1.3.3判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定依據(jù)國標(biāo)選擇D490來讀取吸光度。在陰、陽對(duì)照血清成立的情況下，待檢血清特異抗原孔D值≥0.2、待檢血清特異抗原孔D值/陰性對(duì)照特異抗原孔D值≥2.1， 判為陽性。否則判為陰性。待檢血清處于臨界值（D值=0.2± 0.01，D值變化率≤5%），同時(shí)待檢血清特異抗原孔D值/陰性對(duì)照特異抗原孔D值≥2.1時(shí)，需要復(fù)檢。復(fù)檢結(jié)果與初檢結(jié)果一致，則按初檢結(jié)果進(jìn)行判定；復(fù)檢結(jié)果與初檢結(jié)果不一致，則需要二次復(fù)檢，二次復(fù)檢結(jié)果符合陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果判為陽性，二次復(fù)檢結(jié)果符合陰性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果判為陰性［18］。

1.3.4正?？乖c特異抗原、酶結(jié)合物最佳工作濃度的確定將陰、陽對(duì)照血清和待檢血清1∶40稀釋［5，15-18］。正常抗原分別以0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、 0.2 μg/mL、0.4 μg/mL進(jìn)行包被，特異抗原分別以5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL進(jìn)行包被，羊抗沙鼠IgG-HRP以1∶5 000～1∶64 000倍比稀釋，采用方陣滴定法確定正?？乖⑻禺惪乖兔附Y(jié)合物最佳工作［5，15-17］。

1.3.5特異度試驗(yàn)用已建立的ELISA法分別檢測(cè)沙鼠SV、Reo3、MHV、TMEV陰性血清和陽性血清，同時(shí)設(shè)沙鼠LCMV標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清對(duì)照［5，15-17］。

1.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)將4 ℃放置0 d、30 d和90 d 的3個(gè)不同批次抗原包被板，同時(shí)檢測(cè)已知4份陰性血清和4份陽性血清，計(jì)算D490變化率（相對(duì)偏差），確定ELISA法的穩(wěn)定性［5，15-17］。

1.3.7精密性試驗(yàn)同一份陽性血清的同一稀釋度用同一批板同時(shí)做20孔， 計(jì)算D490的變異系數(shù)［5，15-17］。

將4 ℃放置0 d、30 d、60 d和90 d的4個(gè)不同批次抗原包被板，同時(shí)檢測(cè)不同抗體水平的同8份陰性血清和同8份陽性血清，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算批間平均變異系數(shù)［5，15-17］。

1.3.8靈敏度試驗(yàn)LCMV抗體陽性血清從1∶40開始作系列倍比稀釋，用建立的ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，最大稀釋比例陽性孔（D490≥0.2）為其檢測(cè)靈敏度［5，15-17］。

1.3.9初步應(yīng)用用建立的ELISA方法， 檢測(cè)63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清、42份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清。

1.3.10可信度用XpressBio公司商品化LCMV抗體ELISA檢測(cè)試劑，檢測(cè)63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清和42份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所建立ELISA方法的可信度［5，15-17，19-20］。

2　結(jié)果

2.1病毒感染力滴度

LCMV病毒感染力滴度為7.25 lgTCID50/mL。

2.2抗原濃度測(cè)定

Vero正常抗原蛋白含量為： 1.264 mg/mL； 特異抗原LCMV蛋白含量分為5.732 mg/mL。

2.3最佳工作條件確定

正?？乖?、特異抗原和兔抗沙鼠IgG-HRP最佳工作濃度分別為0.4 μg/mL、10 μg/mL和1∶5 000。

2.4特異度

在LCMV陰性對(duì)照血清和陽對(duì)照血清均成立的條件下，與SV、Reo3、MHV和TMEV陰性對(duì)照血清、陽性血清均無特異性反應(yīng)（表1）。

2.5穩(wěn)定性

8份血清經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A值變化率（相對(duì)偏差）均小于25%（表2）。

2.6精密性

2.6.1批內(nèi)變異系數(shù)測(cè)定通過同一份血清同時(shí)檢測(cè)20個(gè)復(fù)孔的測(cè)定結(jié)果，得出正常抗原和特異抗原批內(nèi)變異系數(shù)分別為6.8%和8.9%（表3）。

根據(jù)不同時(shí)間檢測(cè)16份血清D490變化率，得出正常抗原、特異抗原的批間平均變異系數(shù)（CV）分別為9.3%和8.4%。

表1　ELISA方法特異度試驗(yàn)Table 1 Detection results of the specificity of ELISA

表2　ELISA方法穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定Table 2 Detection results of the stability of ELISA

表3　ELISA方法批內(nèi)變異系數(shù)測(cè)定Table 3 Detection results of the batch variation coefficien of ELISA

2.7靈敏度

通過對(duì)不同稀釋度的陽性對(duì)照的檢測(cè)，得出檢測(cè)方法的靈敏度為1∶1 280（表4）。

2.8初步應(yīng)用

用已建立的ELISA方法檢測(cè)63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清， LCMV抗體陽性率為6.3%（4/63）；檢測(cè)首都醫(yī)科大學(xué)20份經(jīng)凈化的長爪沙鼠血清和浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心開放環(huán)境飼養(yǎng)的22份長爪沙鼠血清，抗體均為陰性。

2.9可信度測(cè)定

用XpressBio公司檢測(cè)試劑檢測(cè)LCMV抗體陰性的101份血清，結(jié)果均為陰性，檢測(cè)LCMV抗體陽性的4份血清，結(jié)果均為陽性。檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

表4　間接ELISA方法靈敏度測(cè)定（D490）Table 4 Detection results of the sensivity of ELISA

3　討論

LCMV廣泛存在于世界各地的鼠群中，在自然條件下僅感染嚙齒類動(dòng)物中的鼠科和倉鼠科動(dòng)物，長爪沙鼠在分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉鼠科， 是LCMV在自然條件下可感染的倉鼠科動(dòng)物之一［8］。應(yīng)賢平等［6］經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)屏障系統(tǒng)長爪沙鼠和開放飼養(yǎng)的長爪沙鼠LCMV抗體陽性率分別為1.3%和6.0%，段明麗等［7］檢測(cè)我國內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)野生長爪沙鼠抗體陽性率為13.3%。而且LCMV是人獸共患病，動(dòng)物一旦感染，不僅會(huì)影響生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)，還會(huì)對(duì)飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)人員帶來潛在危險(xiǎn)，另外LCMV可經(jīng)胎盤垂直傳播，給動(dòng)物的凈化增加了困難［8］。因此，LCMV感染也是實(shí)驗(yàn)長爪沙鼠標(biāo)準(zhǔn)化研究中亟需解決的問題之一。ELISA方法具有微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便、安全和結(jié)果客觀等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域，在理論研究和實(shí)際工作中都發(fā)揮了重要作用［21］。本實(shí)驗(yàn)建立了長爪沙鼠LCMV抗體ELISA方法，為沙鼠的凈化提供檢測(cè)手段。

試驗(yàn)用Vero細(xì)胞培養(yǎng)LCMV作抗原，雖經(jīng)過蔗糖純化，但也會(huì)存在細(xì)胞類等非特異性物質(zhì)，為排除細(xì)胞類等物質(zhì)可能引起的非特異性反應(yīng)，同時(shí)用處理過的Vero細(xì)胞作正?？乖瓕?duì)照，可以有效排除非特異性反應(yīng)而造成的假陽性，提高了檢測(cè)結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性［5，15-17］。ELISA方法的批內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，批間平均變異系數(shù)均小于15%， 說明精密性良好［5，15-17］； 靈敏度達(dá)到1∶1 280，說明敏感性較高［5，15-17］； 特異度試驗(yàn)顯示，與小鼠仙臺(tái)病毒和小鼠呼腸孤病毒3型均無免疫交叉反應(yīng)，證明ELISA方法的特異度令人滿意［5，15-17］。

用建立的ELISA方法檢測(cè)63份普通環(huán)境飼養(yǎng)的長爪沙鼠血清，結(jié)果顯示， 抗體陽性率為6.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］的開放飼養(yǎng)長爪沙鼠LCMV抗體陽性率（6.0%）基本相符。說明開放飼養(yǎng)的沙鼠確實(shí)攜帶LCMV。檢測(cè)首都醫(yī)科大學(xué)20只經(jīng)凈化長爪沙鼠和浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心22只凈化長爪沙鼠，抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。說明經(jīng)過凈化的沙鼠群LCMV感染率降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能說明這兩個(gè)不同地區(qū)凈化沙鼠群的感染情況，如果確切了解凈化后的沙鼠群是否攜帶LCMV，還需擴(kuò)大檢測(cè)樣本量，或長期跟蹤檢測(cè)?？尚哦仍囼?yàn)中， 用XpressBio公司檢測(cè)試劑檢測(cè)同一批105份血清， 有101份陰性，4份陽性，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%，說明建立的ELISA法靈敏度高、準(zhǔn)確性好［5，15-17］。

雖然早在1995年就建立了長爪沙鼠MHV ELISA檢測(cè)方法［6］， 且當(dāng)時(shí)已應(yīng)用于長爪沙鼠的檢測(cè)，但該方法是通過肉眼觀察判斷結(jié)果，在檢測(cè)結(jié)果判斷上主觀性比較強(qiáng)，且此方法并沒有推廣［5，7，15-17］。本次試驗(yàn)建立的長爪沙鼠LCMV ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果是通過儀器（酶標(biāo)儀： Thermo MULTISKAN MK3）進(jìn)行檢測(cè)， 因此檢測(cè)結(jié)果更加客觀可靠［5，15-17］。段明麗等［7］在2013年用ELISA方法對(duì)長爪沙鼠進(jìn)行了LCMV的檢測(cè)，使用的檢測(cè)抗原來源于本實(shí)驗(yàn)室。作者在用本實(shí)驗(yàn)室抗原作為檢測(cè)抗原的基礎(chǔ)上，對(duì)方法的特異度、靈敏度、穩(wěn)定性、精密性等均作了充分的驗(yàn)證，還通過與國外商品化檢測(cè)試劑進(jìn)行比較，來驗(yàn)證所建立的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可信度［17］。

作者建立的長爪沙鼠LCMV抗體ELISA檢測(cè)方法特異、敏感、穩(wěn)定，精密性好、檢測(cè)準(zhǔn)確性高，操作快速、簡便、易于推廣，為長爪沙鼠LCMV抗體檢測(cè)試劑盒的研制及開展沙鼠LCMV的檢測(cè)工作和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment and Preliminary Application of ELISA in Detecting Lymphocytic Choriomeningitis Virus Antibody in Mongolian Gerbil

WANG Ji， WEI Li， FU Rui， LI Xiao-bo， WANG Shu-jing， XING Jin，F(xiàn)ENG Yu-fang， GONG Wei， YUE Bing-fei， HE Zheng-ming
（National Institutes for Food and Drug Control， National Center for Quality of Laboratory Animal， Beijing 100050， China）

Objective To develope the ELISA method for determination of lymphocytic choriomeningitis virus （LCMV） antibody in Mongolian gerbils. Methods Raised the Vero cell， vaccinated the LCMV， prepared the normal Vero antigen and specific LCMV antigen， titrated the best working density of enzyme union， the normal and specific antigen and verified the specificity， sensitivity， accuracy and stability of the method. Result The best working density of normal， specific antigen and the enzyme union were 0.4 μg/mL， 10 μg/mL and 1∶5 000， respectively. The inter-assay coefficient of variation of normal antigen and specific antigen were 6.8% and 8.9%， respectively， the intra-assay average coefficient of variation were 9.3% and 8.4%， respectively. The detection sensitivity was 1∶1 280. There was no cross-reactivity with mammalian orthoreovirus 3 （Reo3） and murine encephalomyelitis virus （M-TMEV）. The stability test shows the relative deviation was below 25%. Conclusion The ELISA method is good in specificity， sensitivity， duplication， and stability， so ELISA could be used in detecting the LCMV antibody.

Lymphocytic choriomeningitis virus （LCMV）；ELISA； Mongolian gerbil

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0473-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.009

2015-06-15

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013BAK11B01）

王吉（1974-）， 女， 副研究員， 研究方向： 微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail： wj_nd_jds@sina.com

賀爭鳴（1957-）， 博士， 男， 研究員，研究方向： 微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail： zhengminghe57@163.com