張云麗， 婁淑杰

（1. 上海體育學院 運動科學學院， 上海 200438； 2. 聊城大學體育學院， 聊城 252059）

高脂膳食和跑臺運動對雄性大鼠腓腸肌腺苷酸活化蛋白激酶 /乙酰輔酶A羧化酶信號通路和膜蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶蛋白含量的影響

張云麗1，2， 婁淑杰1

（1. 上海體育學院 運動科學學院， 上海 200438； 2. 聊城大學體育學院， 聊城 252059）

目的 探討高脂膳食和8周有氧耐力運動對大鼠腓腸肌腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/乙酰輔酶A羧化酶（ACC）信號通路和膜蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36含量的影響。方法 建立營養(yǎng)性肥胖大鼠模型，并隨機分為肥胖安靜組（OC組）和肥胖運動組（OE組），另設普通飼料安靜組（NC組）和普通飼料運動組（NE組）。運動干預結(jié)束后檢測腓腸肌AMPKα、p-AMPKα、ACC、p-ACC和膜蛋白CD36的蛋白水平。結(jié)果 1） NE組與NC、OE及OC組相比，p-AMPKα的蛋白水平顯著升高（P＜0.01）； OC組p-AMPKα的蛋白水平顯著低于NC組（P＜0.01）。2） OC組p-ACC蛋白水平顯著低于NC組（P＜0.01）； OE組p-ACC的蛋白水平顯著高于OC組（P＜0.01）。3） NE組與NC、OE及OC組相比，OC組與NC組相比，膜蛋白CD36含量均無顯著性變化（P＞0.05）。結(jié)論 1） 運動可改善高脂膳食引起的AMPK/ACC信號通路障礙。2） 運動對體質(zhì)量不同大鼠p-ACC蛋白水平的影響存在差異。3） 腓腸肌膜蛋白CD36的含量并沒有伴隨AMPK/ACC信號通路的激活或抑制而發(fā)生顯著變化。

跑臺運動； 高脂膳食； 肥胖； 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）； 乙酰輔酶A羧化酶（ACC）；脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是調(diào)節(jié)細胞能量平衡的關(guān)鍵酶，激活AMPK將導致乙酰輔酶A羧化酶（ACC）受抑制，隨后通過促進脂肪酸氧化、葡萄糖攝取等過程并抑制脂肪合成、蛋白質(zhì)合成以及糖異生等途徑來調(diào)節(jié)機體的能量平衡［1-3］。既往研究表明［4］， 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36廣泛存在于脂肪酸代謝活躍的組織， 與脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)， AMPK/ACC信號通路和CD36均與骨骼肌脂肪酸氧化代謝相關(guān)，在肥胖的形成中具重要作用，但高脂膳食和運動對AMPK/ACC信號通路以及CD36的影響尚無定論。從檢索到的文獻看，目前有關(guān)高脂膳食和運動對AMPK/ACC信號通路和CD36蛋白含量影響的相關(guān)報道逐漸增多，但是由于動物模型、運動方案、組織樣本選擇以及檢測亞基類型等的不同，造成研究結(jié)果并不一致，并且CD36蛋白含量與AMPK/ACC信號通路激活之間的關(guān)系尚不明確。作者前期研究表明［5］，同一強度運動對相同性別、相同年齡的體質(zhì)量正常大鼠和肥胖大鼠的脂肪組織量以及血清TG水平的影響存在差異性，那么這種差異性是否與AMPK/ACC信號通路以及CD36蛋白含量的不同有關(guān)？

針對上述問題， 本研究以普通飲食的體質(zhì)量正常和高脂飲食誘導的肥胖大鼠為研究對象， 探討高脂膳食和8周有氧耐力運動對大鼠腓腸肌AMPK/ACC信號通路以及膜蛋白CD36含量的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

7周齡清潔級雄性SD大鼠70只， 體質(zhì)量190± 10 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2013-0016］。

1.2主要試劑及儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、BeyoECL Plus （超敏ECL化學發(fā)光試劑盒）及PVDF膜購于碧云天生物試劑公司； 兔單克隆抗體AM PK α、pAMPKα-Thr172， 兔多克隆抗體ACC、pACC-Ser79及辣根酶標記的羊抗兔IgG二抗、彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準均購于 Cell Signaling公司；兔多克隆抗體CD36購于Santa Cruz公司；兔多克隆抗體GAPDH購于杭州賢至生物科技有限公司；膜蛋白，核蛋白和胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒購于生工生物工程（上海）有限公司； 蛋白質(zhì)電泳儀、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移裝置購于美國Biorad公司。

1.3模型構(gòu)建及分組

普通飼料適應性喂養(yǎng)后，隨機分為普通飼料組（n=20，C組）和高脂飼料組（n=50，H組）。正式實驗第8周末，將普通飼料組大鼠隨機分為普通飼料安靜組（n=9，NC組，1只在實驗過程中因病死亡）和普通飼料運動組（n=10，NE組）； 選取高脂飼料組中體質(zhì)量超過普通飼料組大鼠平均體質(zhì)量加1.4倍標準差的大鼠， 并隨機分為肥胖安靜組（n=10，OC組）和肥胖運動組（n=8，OE組，2只不能完成運動被淘汰），繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)直至實驗結(jié)束， 其余淘汰。基礎飼料及高脂飼料均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（表1）。大鼠飼養(yǎng)于清潔級設施［SYXK（滬）2012-0003］，每籠3～5只，自由攝食和飲水，動物房溫度22±2℃，相對濕度50%± 10%，光照遵循12 h∶12 h明暗周期。

表1　飼料主要營養(yǎng)成分構(gòu)成 %

1.3體質(zhì)量監(jiān)測

整個實驗過程中，每周六上午固定時間稱量大鼠體質(zhì)量（第17周除外）。

1.4運動方案

NC組和OC組不運動。NE組和OE組經(jīng)1周適應性運動后進行8周坡度0°跑臺運動， 1 次/日，5 次/周。運動負荷安排如下： 按11 m/min， 10 min/d開始運動， 之后每日以1 m/min增加運動速度， 5 min/d增加運動時間， 直至跑速為18 m/min，運動時間為40 min/d。然后維持跑速為18 m/min，運動時間為40 min/d，直至實驗結(jié)束。

1.5標本采集與儲存

末次運動結(jié)束后24 h，禁食過夜，每組大鼠中隨機選取 6只，常規(guī)麻醉，斷頭處死，迅速分離左側(cè)腓腸肌，凍存于液氮中，后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存待測。

1.6Western blotting法檢測腓腸肌蛋白表達

稱取腓腸肌組織100 mg，用蛋白抽提試劑盒依次提取胞質(zhì)蛋白（用于檢測AMPKα、p-AMPKα-Thr172、ACC、p-ACC-Ser79）和膜蛋白（用于檢測CD36）。BCA法檢測樣品蛋白濃度，用裂解液將各組樣品的蛋白濃度調(diào)平后，加入相應量蛋白上樣緩沖液（5×），沸煮10 min，進行SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。然后用5%的脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，接著依次與相應一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗1 h后，TBST洗膜3次，每次5 min，后用ECL化學發(fā)光劑在X線下曝光、顯影。Gel Doc EZ凝膠成像儀將X光片掃描成圖像并保存為電腦文件后，用Image J軟件進行圖像分析。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2　結(jié)果

2.1實驗動物數(shù)量分析

第8周末分組前共納入大鼠70只，第8周末分組時共納入大鼠40只，后續(xù)實驗中1只因病死亡，2只不能完成運動被淘汰。37只大鼠進入體質(zhì)量結(jié)果的分析。運動干預結(jié)束后隨機選取24只大鼠進行蛋白表達的結(jié)果分析。

2.2不同組別大鼠體質(zhì)量變化

運動干預前， 高脂膳食組大鼠的體質(zhì)量自第2 周起就始終顯著高于普通飼料組大鼠（P＜0.01）， 表明高脂膳食可引起大鼠肥胖。運動干預過程中， 正常運動組大鼠的體質(zhì)量在第14周、15周、16周出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05）， 而肥胖運動組大鼠的體質(zhì)量自第10周起就始終顯著低于肥胖對照組大鼠（P＜0.01）（圖1）。提示運動干預引起正常大鼠體質(zhì)量適度下降， 但顯著降低肥胖大鼠的體質(zhì)量。

2.3不同組別大鼠骨骼肌AMPKα、p-AMPKα-Thr172、ACC和p-ACC-Ser79蛋白表達

肥胖大鼠骨骼肌AMPKα和ACC含量均無顯著性變化（P＞0.05， P＞0.05）， p-AMPKα-Thr172和p-ACC-Ser79表達均明顯降低（P＜0.01， P＜0.01）； 運動干預對正常和肥胖大鼠骨骼肌AMPKα和ACC含量均無顯著性影響（P＞0.05， P＞0.05）， 但正常和肥胖大鼠骨骼肌p-AMPKα-Thr172的含量明顯升高（P＜0.01）， 對正常大鼠骨骼肌p-ACC-Ser79含量無明顯影響， 但肥胖大鼠骨骼肌p-ACC-Ser79的含量明顯升高（P＜0.01）（圖2）。

圖1　各組大鼠體質(zhì)量變化曲線

圖2　不同組別大鼠腓腸肌A-MPKα、p-AMPKα-Thr172、ACC和p-ACC-Ser79蛋白表達變化情況

2.4不同組別大鼠腓腸肌膜蛋白CD36表達

肥胖大鼠骨骼肌膜蛋白CD36表達無顯著性變化（P＞0.05）； 運動干預對正常大鼠和肥胖大鼠骨骼肌膜蛋白CD36表達均無顯著性影響（P＞0.05， P＞0.05）（圖3）。

3　討論

本研究采用高脂膳食構(gòu)建的肥胖大鼠體質(zhì)量明顯高于普通膳食大鼠，成功建立肥胖大鼠模型。

3.1肥胖大鼠腓腸肌AMPK/ACC信號通路障礙

在哺乳動物中， AMPK的活性與細胞能量水平密切相關(guān)，AMPK的下游蛋白ACC是脂肪酸代謝的限速酶，在脂肪酸的分解或者合成代謝過程中起著重要作用。AMPK和ACC的活性均受營養(yǎng)狀態(tài)的調(diào)節(jié)。有研究顯示［6］， 長期高脂膳食誘導的肥胖或胰島素抵抗大鼠骨骼肌中AMPK總蛋白含量及磷酸化水平均有顯著的減少。Liu等［7］研究表明， 5個月的高脂膳食誘導大鼠骨骼肌AMPKα蛋白含量、p-AMPKα蛋白水平以及AMPKα 2 mRNA水平顯著降低， 此外p-ACC的蛋白水平和p-ACC mRNA水平亦顯著降低。但孫婧瑜等［8］研究顯示， 8周高脂膳食對小鼠骨骼肌AMPK和ACC的蛋白磷酸化水平?jīng)]有顯著影響。導致不同研究結(jié)果的原因可能與高脂膳食的構(gòu)成和喂養(yǎng)周期以及實驗動物的種屬差異有關(guān)。

與Liu等［7］研究相一致，本研究中長期高脂膳食引起p-AMPKα和p-ACC的蛋白水平均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.01），說明高脂膳食可以降低AMPK/ACC信號通路的激活，引起骨骼肌ACC活性增強，進而使骨骼肌脂肪合成作用增強而脂肪酸氧化作用受到抑制，這與高脂膳食引起大鼠體質(zhì)量增加，進而導致肥胖有關(guān)。

3.2運動對大鼠腓腸肌AMPK/ACC信號通路影響

當運動引起機體能量消耗增加時，細胞內(nèi)AMPK的活性增加，使ACC磷酸化增加而活性降低，進而減少脂肪酸合成并提高脂肪酸的氧化速度，以適應運動對能量增加的需求［9］。孫婧瑜等［8］研究表明，8周自主跑輪運動的小鼠，其骨骼肌AMPK的蛋白磷酸化水平顯著增加， 同時ACC的蛋白磷酸化水平也伴隨AMPK的激活而顯著增加。本研究結(jié)果顯示， 不論是高脂飼料組還是普通飼料組，8周中等強度的有氧耐力運動均可引起p-AMPKα的蛋白水平增加，但與以往研究不同的是， 本研究顯示運動對體質(zhì)量不同大鼠p-ACC蛋白水平的影響存在差異， 8周中等強度的有氧耐力運動引起肥胖大鼠p-ACC的蛋白水平顯著增加（P＜0.01）， 但對體質(zhì)量正常大鼠的p-ACC蛋白水平卻無顯著影響（P＞0.05）。本研究選取SD大鼠作為研究對象，采用被動跑臺運動方式，而孫婧瑜等［8］以C57BL小鼠為研究對象，采取自主轉(zhuǎn)輪運動方式。實驗動物和運動方式不同可能是導致研究結(jié)果出現(xiàn)差異的原因。作者以往研究表明［5］，8周中等強度的有氧耐力運動可有效減少肥胖大鼠的脂肪組織量，但對體質(zhì)量正常大鼠無明顯影響，其原因可能與運動對肥胖大鼠和體質(zhì)量正常大鼠的p-ACC蛋白水平的影響不同，進而造成脂肪酸氧化水平的差異所致。但是，運動對體質(zhì)量不同大鼠p-ACC蛋白水平產(chǎn)生差異性影響的深層次原因仍有待進一步探討。

圖3　不同組別大鼠腓腸肌膜蛋白CD36表達

3.3肥胖大鼠腓腸肌膜蛋白CD36表達

人類和動物模型的研究表明， 疾?。ɡ绶逝值倪M展， 胰島素抵抗和II型糖尿病）的發(fā)病機理與脂肪酸轉(zhuǎn)運體有關(guān)聯(lián)。脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運涉及多種膜蛋白， 其中CD36最受研究者的關(guān)注。Cameron-Smith等［10］研究表明， 短期高脂膳食能夠增加受試者脂代謝水平及骨骼肌CD36的總蛋白含量。而孫婧瑜等［8］研究表明，8周的高脂膳食導致骨骼肌CD36總蛋白表達水平顯著下降， 分析原因可能與高濃度的脂肪酸引起骨骼肌CD36蛋白泛素化水平增加有關(guān)［11］?？梢?，高脂膳食對骨骼肌CD36總蛋白的影響尚無定論，甚至存在相反的研究結(jié)果。

Ring等［12］研究表明，胞質(zhì)內(nèi)的CD36不能有效轉(zhuǎn)運脂肪酸。Bonen等［13］通過對肥胖、超重、偏瘦及Ⅱ型糖尿病人群進行調(diào)查，顯示4組人群骨骼肌CD36總蛋白含量并無差異性，但是肥胖和Ⅱ型糖尿病人群骨骼肌細胞膜上FAT/CD36含量較其他兩組均有差異性。但與上述研究不同，本研究結(jié)果顯示，長期高脂膳食對大鼠腓腸肌膜蛋白CD36的表達水平并無顯著性影響（P＞0.05）。有研究表明，除質(zhì)膜外，CD36還可能存在于細胞內(nèi)的囊泡膜和線粒體膜上［14，15］，而本研究所使用的蛋白抽提試劑盒只能提取總膜蛋白，無法獲得純化的質(zhì)膜蛋白和線粒體膜蛋白，這可能是導致長期高脂膳食對腓腸肌膜蛋白CD36的表達水平無顯著性影響的一個原因，提示在某些實驗條件下僅僅分離胞質(zhì)蛋白和膜蛋白是不夠的，在今后的研究中需要進一步改進實驗條件，以確定高脂膳食對質(zhì)膜和/或線粒體膜CD36含量的影響。

3.4運動對大鼠腓腸肌膜蛋白CD36表達的影響

Schenk等［16］研究表明， 耐力訓練可以增加骨骼肌CD36的總蛋白表達，從而增加脂肪酸的氧化代謝，而Kiens等［17］通過對有兩年以上耐力訓練經(jīng)歷的受試者進行檢測，卻發(fā)現(xiàn)長期的耐力訓練并不能提高股外側(cè)肌CD36的總蛋白表達水平。Chabowski等［18］研究表明， AMPK的激動劑AICAR在激活心肌細胞 AMPK的同時， CD36的基因及蛋白表達水平均出現(xiàn)顯著增加。本研究結(jié)果顯示， 8周中等強度的有氧耐力跑臺運動對普通飼料和高脂飼料大鼠腓腸肌膜蛋白CD36含量均無顯著性影響（P＞0.05）， 提示運動在激活AMPK/ACC信號通路的同時并沒有增加膜蛋白CD36的含量。那么這是否意味著8周中等強度的有氧耐力跑臺運動一定不會改變骨骼肌細胞的脂肪酸攝取呢？首先， 骨骼肌組織中多種蛋白被證明具有脂肪酸轉(zhuǎn)運促進作用， 比如CD36、脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（FATP等）［19］，因此8周中等強度的有氧耐力運動能否影響其他轉(zhuǎn)運體是未知的。其次，被動擴散和蛋白介導的脂肪酸運輸可能均有助于細胞的脂肪酸攝取。有研究者指出［20］，脂肪酸以擴散形式進行跨膜轉(zhuǎn)運可能是獨立發(fā)生的或是蛋白介導脂肪酸轉(zhuǎn)運過程一部分，膜脂質(zhì)雙層的特性和脂肪酸結(jié)合膜蛋白均會影響細胞對脂肪酸的攝取。這也許可以解釋為什么在某些細胞系脂肪酸轉(zhuǎn)運體CD36的增加并不伴有脂肪酸攝取的增加［21，22］?？梢?，無論是高脂膳食還是運動對CD36的影響及其機制的研究仍需要大量的工作進行驗證。

本研究提示，8周中等強度的有氧耐力運動可改善高脂膳食引起的大鼠腓腸肌AMPK/ACC信號通路障礙，并且相同強度的有氧耐力運動對相同性別和月齡的體質(zhì)量正常和肥胖大鼠腓腸肌p-ACC的蛋白水平的影響存在差異性。此外， 本研究并沒有發(fā)現(xiàn)大鼠腓腸肌膜蛋白CD36的含量伴隨AMPK/ACC信號通路的激活或抑制而發(fā)生顯著變化。在以后的研究中，將進一步確定高脂膳食和有氧耐力運動對質(zhì)膜和/或線粒體膜CD36含量的影響。

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Effects of High-fat Diet and Treadmill Exercise on AMP-activated Protein Kinase （AMPK）/Acetyl-CoA Carboxylase （ACC） Signaling Pathway and Fatty Acid Translocase CD36 Protein Content in Rat Gastrocnemius Muscle

ZHANG Yun-li1，2， LOU Shu-jie1
（1. Shanghai University of Sport， Shanghai 200438， China；2. Liaocheng University， Liaocheng 252059， China）

Objective To investigate the effects of high-fat diet and 8 weeks aerobic endurance exercise （treadmill exercise） on AMP-activated protein kinase （AMPK）/acetyl-CoA carboxylase （ACC）signaling pathway and fatty acid translocase CD36 protein content in rat gastrocnemius muscles. Methods A rat model of nutritional obesity was established by feeding rats a high-fat diet， and then the obese rats were randomly divided into obese control group （OC group） and obese exercise group （OE group）； In addition， a normal diet control group （NC group） and a normal diet exercise group （NE group）were set up. The exercise groups （OE and NE groups） were arranged by aerobic endurance exercise for 8 weeks. After the experiment， the levels of AMPKα， p-AMPKα， ACC， p-ACC and membrane protein CD36 in all groups were detected by Western blotting in gastrocnemius muscles. Results 1） Compared with the NC group， p-AMPKα protein levels had a significant increase in the NE group （P＜0.01）. p-AMPKα protein levels in the OE group were significantly higher than that in the OC group （P＜0.01）. p-AMPKα protein levels in the OC group were significantly lower than that in the NC group （P＜0.01）. 2） Compared with the NC group， p-ACC protein level in the OC group were significantly decreased （P＜0.01）. p-ACC protein levels had a significant increase in the OE group as compared with the OC group （P＜0.01）. 3） Compared between the NE group and NC group， the OE group and OC group， and the OC group and NC group， the content of membrane protein CD36 showed no significant change （P＞0.05）. Conclusion 1） The treadmill exercise could improve AMPK/ACC signaling pathway. 2） The impacts of exercise on p-ACC levels were different in rats with different body mass. 3） The membrane protein CD36 content in the rat gastrocnemius muscles did not significantly change whether AMPK/ACC signaling pathway was activated or inhibited.

Treadmill exercise； High-fat diet； Obesity； AMP-activated protein kinase（AMPK）；Acetyl-CoA carboxylase （ACC）； Fatty acid translocase CD36

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0441-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.003

2015-07-25

國家自然科學基金（81572241）； 上海市人類運動能力開發(fā)與保障重點實驗室（上海體育學院）（NO.11DZ2261100）； 上海體育學院研究生教育創(chuàng)新基金資助項目（xsxr2013030）

張云麗（1977-）， 女， 博士研究生。E-mail： ylzhwl@foxmail.com

婁淑杰（1963-）， 女， 教授， 博士研究生導師。E-mail： shujielou319@163.com