王莎莎， 賀爭(zhēng)鳴

（中國(guó)食品藥品檢定研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100050）

猴巨細(xì)胞病毒巢式PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

王莎莎， 賀爭(zhēng)鳴

（中國(guó)食品藥品檢定研究院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100050）

目的 建立猴巨細(xì)胞病毒（SCMV）特異的巢式PCR檢測(cè)方法并研究實(shí)驗(yàn)猴群和猴源性生物制品中SCMV感染或污染情況。 方法 比對(duì)分析多株SCMV序列，設(shè)計(jì)SCMV特異引物，優(yōu)化巢式PCR實(shí)驗(yàn)條件，建立的巢式PCR方法經(jīng)驗(yàn)證后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴群和猴源性生物制品。 結(jié)果 經(jīng)特異度和靈敏度鑒定，在設(shè)計(jì)的4對(duì)引物中確定一對(duì)最佳引物，可以區(qū)分SCMV和人巨細(xì)胞病毒（HCMV）、小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）、單純皰疹病毒（HSV）以及犬皰疹病毒（CHV），且可以檢測(cè)到的最小DNA量為18 pg/mL。PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴群和相關(guān)生物制品，發(fā)現(xiàn)SCMV在實(shí)驗(yàn)猴群中廣泛存在，在相關(guān)生物制品中有感染的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，PCR檢測(cè)方法具有很好準(zhǔn)確性，初步應(yīng)用表明我國(guó)實(shí)驗(yàn)猴群中SCMV高度流行，應(yīng)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)猴群及相關(guān)生物制品中SCMV的監(jiān)測(cè)，避免人類感染SCMV的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

猴巨細(xì)胞病毒（SCMV）； 巢式 PCR； 實(shí)驗(yàn)猴群； 猴相關(guān)生物制品

猴巨細(xì)胞病毒（SCMV）為線性雙鏈DNA病毒，為β亞型皰疹病毒，基因組全長(zhǎng)為196～241 kbp，獼猴和食蟹猴SCMV的G+C含量為49%， 具有人巨細(xì)胞病毒（HCMV）的基因組結(jié)構(gòu)特征， 是HCMV致病性研究的良好模型［1］，也是猴獲得性免疫缺陷病毒（SIV）疫苗研究強(qiáng)有力的候選載體［2］。近年來(lái)SCMV還作為病毒疫苗載體構(gòu)建HIV疫苗，能夠給預(yù)接種疫苗動(dòng)物一定程度的病毒清除［3］。PCR方法由于其安全、快速的特點(diǎn)在相關(guān)檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。作者建立的巢式PCR方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測(cè)猴群中SCMV的感染情況，并且靈敏度和特異性比普通PCR高。該方法還可應(yīng)用于猴源性生物制品SCMV污染的檢測(cè)，為保證生物制品應(yīng)用的安全性提供依據(jù)，同時(shí)也為開展SCMV基因組的研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1樣品與毒株來(lái)源

方法的初步應(yīng)用使用了猴全血樣品、猴口腔棉拭子樣品、猴組織樣品、猴源性細(xì)胞以及相關(guān)生物材料等。共檢測(cè)40份猴全血樣品（獼猴、食蟹猴各20份）； 猴口腔棉拭子40份（獼猴、食蟹猴各20份）； 3組猴組織樣品（獼猴2組， 食蟹猴1組）， 均采集于猴場(chǎng)。5株實(shí)驗(yàn)室常用猴源傳代細(xì)胞包括猴腎細(xì)胞BSC-1， 非洲綠猴腎細(xì)胞Vero、Vero-E6， 羅猴胎腎細(xì)胞MA104， 獼猴腎細(xì)胞MK2， 均為本實(shí)驗(yàn)室保存。3批猴源生物材料， 為本院疫苗三室贈(zèng)送。

所使用的毒株包括HCMV（本院疫苗三室贈(zèng)送），單純皰疹病毒（HSV）、小鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）、貓皰疹病毒（FHV）、犬皰疹病毒（CHV）以及猴腺病毒（SAdV），均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑及儀器

胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司； PCR熱啟動(dòng)反應(yīng)體系、100 bp DNA Maker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司； PCR反應(yīng)用引物均由北京擎科生物有限公司合成。 DNA快速提取試劑盒購(gòu)自凱杰公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1靶基因的選擇及引物設(shè)計(jì)巨細(xì)胞病毒屬于皰疹病毒β亞型，其保守基因包含皰疹病毒核心基因以及β亞型皰疹病毒特有基因，巨細(xì)胞病毒在宿主之間又高度特異，現(xiàn)選取宿主為獼猴、食蟹猴的巨細(xì)胞病毒基因組的皰疹病毒核心基因UL55、UL56和β亞型皰疹病毒特有基因UL33、UL84為靶基因進(jìn)行比對(duì)選取保守序列，針對(duì)該區(qū)域用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物并合成，建立巢式PCR檢測(cè)方法。同時(shí)，與參照引物進(jìn)行比較［4］。

4組引物（1，2，3，4）及參照引物（5）的序列見表1。

1.3.2基因組DNA提取病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)反復(fù)凍融3次后4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，收集上清。各種血液、組織、細(xì)胞以及生物制品樣品DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書提取DNA， 200 μL樣品提取200 μL DNA， -20 ℃保存。

1.3.3巢式PCR反應(yīng)經(jīng)過(guò)模板量，引物濃度，聚合酶量，循環(huán)數(shù)以及退火和延伸時(shí)間的探索，確定第一循環(huán)的體系和反應(yīng)條件以及第二循環(huán)的體系和條件。

1.3.4巢式 PCR方法的特異度驗(yàn)證

1.3.4.1瓊脂糖凝膠電泳鑒定取HCMV、MCMV、FHV、SAdV、HSV-1、HSV-2、CHV以及正常MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)液。用前述SCMV病毒基因組提取方法提取DNA，以其為模板用設(shè)計(jì)的4組引物與參照引物在優(yōu)化后的條件下分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分析所建立的巢式PCR方法的特異度，并與文獻(xiàn)報(bào)道的方法做比較。

1.3.4.2測(cè)序鑒定利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，通過(guò)初步酶切鑒定，選擇陽(yáng)性克隆送北京擎科公司測(cè)序。

1.3.5靈敏度測(cè)定將起始濃度為180 ng/mL的DNA樣本做倍比稀釋，分設(shè)10-1到10-7七個(gè)濃度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴(kuò)增的最小DNA模板濃度。同時(shí)，用參照引物進(jìn)行相同的操作，并將所建立的PCR方法與文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行靈敏度比較。

1.3.6巢式PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用將建立的巢式 PCR方法應(yīng)用于猴全血樣品、猴口腔棉拭子、猴組織樣品、猴源性傳代細(xì)胞樣品、以及猴源性生物制品樣品，檢測(cè)個(gè)樣品中SCMV的感染狀況。

2　結(jié)果

2.1巢式 PCR反應(yīng)及條件優(yōu)化

巢式 PCR第1組引物，選取UL33作為靶基因， 外引物目的片段730 bp， 內(nèi)引物目的片段439 bp。第2組引物， 選擇UL84作為靶基因， 外引物目的片段463 bp， 內(nèi)引物目的片段310 bp。第3組引物，選擇UL55作為靶基因，外引物目的片段362 bp，內(nèi)引物目的片段197 bp。第4組引物， 選擇UL56作為靶基因，外引物目的片段1 206 bp，內(nèi)引物目的片段768 bp。經(jīng)過(guò)優(yōu)化各組引物均得到最適反應(yīng)體系和條件。其中，優(yōu)化后引物2的內(nèi)外反應(yīng)體系如表2。

外引物循環(huán)反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性4 min； 95 ℃30 s， 46 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，共20個(gè)循環(huán)； 72 ℃再延伸7 min。內(nèi)引物循環(huán)反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性4 min； 95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃再延伸7 min。

2.2巢式 PCR方法的特異度驗(yàn)證

5組引物在以SCMV為模板時(shí)均有明顯的條帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照MRC-5細(xì)胞均無(wú)目的條帶。引物1～4的特異度均很好，除了SCMV樣品中有條帶外，HCMV、MCMV、FHV、SAdV-1/SAdV-20、HSV-1/HSV-2、CHV中都未見有條帶出現(xiàn)。參照引物的特異度較差（圖2），在HCMV、FHV和CHV 的PCR反應(yīng)中出現(xiàn)相同大小的目的條帶，在其他皰疹病毒中也出現(xiàn)了非特異性條帶。

表2　引物2優(yōu)化后的反應(yīng)體系

圖1　引物1、引物2特異性驗(yàn)證

2.3巢式 PCR產(chǎn)物核酸序列分析

將陽(yáng)性擴(kuò)增片斷進(jìn)行克隆測(cè)序， 結(jié)果用BLAST 與NCBI中SCMV序列比對(duì)， 核苷酸符合率達(dá)99%， 證明是要擴(kuò)增的SCMV目的片段， 說(shuō)明該法特異性好。

2.4靈敏度鑒定

將提取核酸濃度為180 ng/mL的SCMV DNA樣本用TE緩沖液做10倍稀釋， 分設(shè)10-1到10-6六個(gè)稀釋度進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。引物2在10-4稀釋度有較明顯條帶， 引物1、引物3和引物4在10-3稀釋度有明顯條帶。對(duì)于檢測(cè)樣品來(lái)說(shuō)，注重于微量DNA的檢測(cè)，故引物2為最優(yōu)檢測(cè)巢式PCR引物，優(yōu)化的體系和反應(yīng)條件為最優(yōu)方法。使用引物2對(duì)所建立的巢式PCR方法進(jìn)行初步應(yīng)用。

2.5檢測(cè)方法的初步應(yīng)用

2.5.1猴全血樣品的檢測(cè)取獼猴、食蟹猴全血樣品各20份，進(jìn)行巢式PCR方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，獼猴全血樣品有5份擴(kuò)增后出現(xiàn)310 bp大小的陽(yáng)性條帶（圖3）， 將PCR產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序， 取5號(hào)樣品結(jié)果與NCBI進(jìn)行比對(duì)， 與180.92株的同源性為98%，與Ottawa株的同源性為97%。食蟹猴全血樣品中未檢測(cè)出SCMV陽(yáng)性（圖4）。

禮者，以財(cái)物為用，以貴賤為文，以多少為異，以隆殺為要。文理繁，情用省，是禮之隆也；文理省，情用繁，是禮之殺也；文理、情用相為內(nèi)外表里，并行而襍，是禮之中流也。故君子上致其隆，下盡其殺，而中處其中。

2.5.2猴口腔棉拭子的檢測(cè)獼猴、食蟹猴口腔棉拭子各20份提取DNA，進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20只獼猴的口腔棉拭子全呈陽(yáng)性結(jié)果， 18只食蟹猴口腔棉拭子陽(yáng)性，2份陰性。

2.5.3猴組織樣品的檢測(cè)取2只獼猴（M1、M2），1只食蟹猴（S1）肝、脾、肺、腎、小腸組織各100 mg，研磨后提取組織細(xì)胞DNA，并對(duì)其進(jìn)行SCMV 巢式 PCR檢測(cè)（圖5）。

2.5.4猴源性傳代細(xì)胞的檢測(cè)BSC-1、MA104、Vero-E6、MEK、Vero細(xì)胞均未檢出SCMV病毒核酸序列（圖6）。說(shuō)明目前實(shí)驗(yàn)室使用的猴源傳代細(xì)胞未受SCMV污染。

2.5.5猴源性生物制品的檢測(cè)對(duì)連續(xù)生產(chǎn)的3批猴源性生物制品進(jìn)行檢測(cè)，顯示有SCMV核酸序列的存在（圖7）。將陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的SCMV UL84基因進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性為98%。

3　討論

SCMV在猴群中多為隱性感染，國(guó)外報(bào)道SCMV在野外猴群的血清抗體陽(yáng)性率達(dá)到90%以上，籠養(yǎng)的猴血清抗體陽(yáng)性率則達(dá)到50%［5］。國(guó)內(nèi)對(duì)猴群中SCMV感染流行情況研究很少，猴源性生物制品中SCMV污染情況尚未見報(bào)道。有學(xué)者針對(duì)SCMV的皰疹病毒核心基因設(shè)計(jì)巢式引物，證明國(guó)內(nèi)籠養(yǎng)猴群中存在SCMV感染［4］。經(jīng)特異度驗(yàn)證該方法特異度較差，不能區(qū)分SCMV與HCMV、FHV以及CHV。

圖3　獼猴全血樣品巢式 PCR結(jié)果

圖4　食蟹猴全血樣品巢式PCR結(jié)果

圖5　猴組織樣品巢式 PCR結(jié)果

圖6　傳代細(xì)胞DNA樣品巢式PCR結(jié)果

圖7　猴源性生物制品樣品巢式PCR結(jié)果

3.1方法建立

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)引物濃度、Taq酶用量、退火溫度、模板量進(jìn)行優(yōu)化并經(jīng)特異性和敏感性驗(yàn)證，成功篩選出一對(duì)特異性好、靈敏度更高的引物，目的條帶大小為310 bp。特異性敏感性結(jié)果表明，本方法可以區(qū)分SCMV與HCMV、MCMV、HSV以及CHV，而且能夠在獼猴和食蟹猴群中檢出SCMV。敏感性驗(yàn)證顯示其能檢測(cè)到的最小DNA模板濃度為18 pg/mL。

3.2猴全血、口腔棉拭子中SCMV的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)將猴全血樣品，口腔棉拭子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)全血樣品中SCMV檢測(cè)陽(yáng)性率較口腔棉拭子的陽(yáng)性率低，說(shuō)明口腔棉拭子可以作為較可靠的SCMV檢測(cè)樣品形式，這與Huff等［6］對(duì)猴的各種體液樣品進(jìn)行的病毒SCMV核酸檢測(cè)，顯示口腔棉拭子的陽(yáng)性率最高的結(jié)果一致。說(shuō)明SCMV在感染個(gè)體中體液的分布有一定的偏好性。

SCMV的初次感染主要通過(guò)口腔黏膜接觸感染病毒的乳汁或唾液， 通過(guò)血液向全身擴(kuò)散。感染早期， 即可在血漿中檢測(cè)出病毒DNA陽(yáng)性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性注射或者灌服獼猴巨細(xì)胞病毒7 d后血漿中檢測(cè)到病毒DNA達(dá)到峰值， 然后會(huì)慢慢減少， 但下降速度隨個(gè)體不同有差異［7］， 有的在注射病毒3周后血漿SCMV 核酸轉(zhuǎn)陰， 有的血漿中的病毒核酸則能一直持續(xù)到11周之后。初次感染猴血漿中的病毒清除后，血漿會(huì)保持長(zhǎng)時(shí)間的SCMV核酸陰性狀態(tài)。接受病毒后2周， 猴組織各器官中可陸續(xù)檢測(cè)到SCMV， 通常被檢測(cè)到的組織包括脾、淋巴管、腎、骨髓、肝、腮腺、頜下腺［7，8］。

3.3猴組織樣品中SCMV的檢測(cè)

免疫功能健全猴個(gè)體中SCMV的自然感染病變主要見于唾液腺、淋巴結(jié)和腎［7］。在猴免疫缺陷病毒感染的個(gè)體中，常見SCMV機(jī)會(huì)感染，SCMV活化感染與腦膜炎、肺炎、淋巴結(jié)炎、脾炎、睪丸炎和神經(jīng)炎的發(fā)展有關(guān)，與大動(dòng)脈以及消化道病變有關(guān)［9，10］。本文作者在組織細(xì)胞的檢測(cè)中，2只猴組織的脾和腎均發(fā)現(xiàn)SCMV DNA陽(yáng)性，而肝、肺和小腸則未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性，與上述論斷一致。獼猴M1的肝、脾、肺、腎出現(xiàn)SCMV陽(yáng)性，而小腸未出現(xiàn)SCMV陰性，可能該獼猴免疫功能較低，使SCMV在體內(nèi)組織細(xì)胞出現(xiàn)大范圍感染。

3.4猴源性生物制品中SCMV的檢測(cè)

由于猴群中常存在SCMV隱性感染， 易導(dǎo)致用于口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV）生產(chǎn)用的原代猴腎細(xì)胞污染［11］。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)室猴源傳代細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)SCMV污染，但猴源性生物制品的SCMV檢測(cè)顯示陽(yáng)性，說(shuō)明生產(chǎn)用猴腎細(xì)胞的SCMV污染嚴(yán)重。猴源性生物制品每批樣品中的陰、陽(yáng)性不一致， 造成該結(jié)果的原因可能是多方面的， 如樣本本身的質(zhì)不均一性、污染來(lái)源以及核酸提取時(shí)質(zhì)不均一性等。如需確定猴源性生物制品中SCMV的污染情況，還需進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本數(shù)量。雖然SCMV有嚴(yán)格的物種特異性， 自然情況下不存在交叉感染，但是不能排除人通過(guò)生物制品接觸病毒后無(wú)害。而2013年錄入NCBI Genbank的毒株strain Colburn記載其來(lái)源于患臨床腦病的男孩， 說(shuō)明生物制品中SCMV的污染對(duì)人類健康存在潛在的威脅。

作者建立的SCMV核酸巢式 PCR檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)際應(yīng)用于監(jiān)測(cè)猴群SCMV感染，也適用于猴源性生物制品SCMV污染的檢測(cè)，對(duì)于建立高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)猴群和保證猴源性生物制品安全具有重大意義。

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Establishment of Nested PCR Detection Method for Simian Cytomegalovirus and Preliminary Application

WANG Sha-sha， HE Zheng-ming
（National Institute for Food and Drug Control， Beijing 100050， China）

Objective To establish simian cytomegalovirus （SCMV） specific nested PCR detection method， and to investigate SCMV infectious status in monkeys and related biological products. Methods Designed primers based on SCMV sequences and different monkey species and biological products were used to optimize the experiment. Results The established nested PCR detection method for SCMV can distinct SCMV from HCMV， MCMV， HSV and CHV， the test sensitivity is to viral DNA 18 pg/mL. By this nested PCR method， SCMV positive results were detected in monkeys and biological products， which suggested the high infection rate existed in monkeys and its biological products. Conclusions Nested PCR detection method has a good accuracy and sensitivity. It is found that high prevalence in Chinese primate colony. It is necessary to enhance detection for SCMV in monkeys and relevant biological products and to avoid potential risk of infecting in human.

Simian cytomegalovirus （SCMV）； Nested PCR； Detection and application

Q95-33

A

1674-5817（2015）06-0467-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.06.008

2015-04-30

國(guó)家科技支撐計(jì)劃， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究（2013BAK11B01）

王莎莎（1989-）， 女， 碩士， 研究方向： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail： wangsha0316@126.com

賀爭(zhēng)鳴（1957-）， 男， 博士， 研究員， 研究方向： 微生物學(xué)。E-mail： hezm@nicpbp.org.cn