樂(lè) 薇，佘雨珊，吳士筠

（武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢430065）

我國(guó)箬葉資源豐富但利用率低，目前主要用作食品包裝。黃酮類(lèi)化合物是植物重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌等多種生理功能[1－3］。研究表明，總黃酮是箬葉中的重要活性成分，但目前的研究多限于黃酮的提取與測(cè)定[4－7］。

作者通過(guò)抑菌圈直徑及最低抑菌濃度的測(cè)定，分別考察乙醇浸漬法、熱回流法、微波法、超聲波法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果，選擇提取箬葉總黃酮的最優(yōu)方法，以期為提高箬葉的附加值和箬葉總黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

箬葉，采于湖北恩施武陵山區(qū)。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、青霉菌（Penicillium）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Moniliaalbican），武漢工商學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氨芐青霉素，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

DHP－9272型恒溫培養(yǎng)箱、HZQ－F160型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱東聯(lián)生化儀器有限公司；YXQ－LS－SⅡ型全自動(dòng)立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；KQ－100E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；M700型美的微波爐，廣東美的微波爐制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 箬葉總黃酮的提取及純化

取適量箬葉清洗干凈，50℃烘干后粉碎，過(guò)18目篩，密封保存。按前期實(shí)驗(yàn)獲得的優(yōu)化條件（表1 ），分別采用乙醇浸漬法、熱回流法、超聲波法及微波法提取箬葉總黃酮，測(cè)定提取液中總黃酮含量并計(jì)算提取率。提取液減壓濃縮蒸去乙醇，并經(jīng)AB－8型大孔樹(shù)脂吸附飽和，用75%乙醇洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮成浸膏，用適量75%乙醇溶解，使各種提取法所得總黃酮的濃度盡可能一致，即得箬葉總黃酮樣品液。

表1 4種提取方法的優(yōu)化條件Tab.1 Optimum conditions of four kinds of extraction method

1.2.2 箬葉總黃酮提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15mg溶于30%乙醇，定容至100mL。用移液管分別取一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，混勻，靜置6min后加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，靜置6min后加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，以30%乙醇定容，搖勻，靜置10min后在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參比為不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的溶液。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程為A＝0.0105c＋0.0017，R2＝0.9998。

以箬葉總黃酮提取液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液同法測(cè)定總黃酮濃度，箬葉總黃酮提取率按下式計(jì)算：

式中：c為總黃酮濃度，μg·mL－1；m為箬葉粉末質(zhì)量，g；V為溶液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 箬葉總黃酮的抑菌實(shí)驗(yàn)

1）抑菌圈的測(cè)定

將供試菌種分別接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面上，細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）于37℃培養(yǎng)24h進(jìn)行活化，真菌（白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌）于28℃培養(yǎng)24h進(jìn)行活化。從活化后的斜面上挑取菌體于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分別吸取各對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液500μL至一定量的無(wú)菌水中，配制濃度為1×106CFU·mL－1的菌懸液，搖瓶培養(yǎng)48h，備用。

將約15mL的固體培養(yǎng)基倒入平板（直徑9cm）中，水平放置，待其凝固后用移液器取0.5mL菌懸液注入平板，并用三角棒涂布均勻，每種菌設(shè)置3個(gè)重復(fù)平板。取滅菌濾紙片（直徑6mm）放入上述各總黃酮樣品液中浸泡24h，取出貼在含菌平板上，用75%乙醇和氨芐青霉素作對(duì)照，每皿貼3片。細(xì)菌置（37±1）℃培養(yǎng)18～24h、真菌置28℃培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。測(cè)定濾紙片的抑菌圈直徑，比較抑菌效果。

2）最低抑菌濃度的測(cè)定

采用連續(xù)稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度。在無(wú)菌條件下，量取一定量箬葉總黃酮提取液，倒入已滅菌的空試管中，再加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中箬葉總黃酮提取液的質(zhì)量濃度（mg·mL－1）分別為2、4、9、20、40，混合均勻，分別接入100μL的菌液后在相應(yīng)條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，觀察菌體生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法對(duì)箬葉總黃酮提取率的影響（表2 ）

表2 提取方法對(duì)箬葉總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of extraction methods on extraction rate of total flavonoids from indocolamus leaves

由表2 可知，熱回流法和超聲波法的總黃酮提取率相當(dāng)，乙醇浸漬法的提取率略低，微波法的提取率最低。

2.2 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果（表3 ）

表3 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的抑菌效果（n＝3）Tab.3 Antibacterial effect of total flavonoids from indocalamus leaves extracted by different extraction methods（n＝3）

由表3 可知，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)4種箬葉總黃酮均較為敏感，釀酒酵母菌對(duì)4種箬葉總黃酮均不敏感，白色念珠菌和青霉菌對(duì)4種箬葉總黃酮部分敏感。其中，大腸桿菌對(duì)4種箬葉總黃酮的敏感程度為：乙醇浸漬法＞超聲波法＞熱回流法＞微波法；金黃色葡萄球菌對(duì)4種箬葉總黃酮的敏感程度為：超聲波法／熱回流法＞乙醇浸漬法＞微波法。超聲波法提取的箬葉總黃酮對(duì)青霉菌有一定的抑制作用，熱回流法提取的箬葉總黃酮對(duì)白色念珠菌有一定的抑制作用。表明，箬葉總黃酮對(duì)細(xì)菌的抑制作用大于對(duì)真菌的抑制作用，且提取方法對(duì)箬葉總黃酮的抑菌能力有影響。這可能是由于不同的提取方法獲得的黃酮種類(lèi)有差異，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3 不同提取方法提取的箬葉總黃酮的最低抑菌濃度（表4）

表4 最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of minimal inhibitory concentration

由表4可知，超聲波法提取的箬葉總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉菌的最低抑菌濃度均為39.9mg·mL－1；熱回流法提取的箬葉總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的最低抑菌濃度均為46.2mg·mL－1；乙醇浸漬法提取的箬葉總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為22.0mg·mL－1，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為44.0mg·mL－1；微波法提取的箬葉總黃酮對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為48.0mg·mL－1。

3 結(jié)論

通過(guò)抑菌圈直徑及最低抑菌濃度的測(cè)定，分別考察乙醇浸漬法、熱回流法、微波法、超聲波法提取的箬葉總黃酮對(duì)細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）、真菌（白色念珠菌、釀酒酵母菌、青霉菌）的抑菌效果。結(jié)果表明，箬葉總黃酮對(duì)細(xì)菌的抑制作用大于對(duì)真菌的抑制作用，且提取方法對(duì)箬葉總黃酮的抑菌能力有影響，不同提取方法提取的箬葉總黃酮抑菌效果為：超聲波法＞熱回流法＞乙醇浸漬法＞微波法。超聲波法比較適合于箬葉總黃酮的提取。

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