徐康寧，黃 娟，王 獻

（中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢430074）

廣金錢草是豆科植物廣金錢草的干燥地上部分，性微寒，具有清熱去濕、排石、利水通淋的功效[1］，臨床主要用于治療腎炎浮腫、尿路感染、膽囊結(jié)石、黃疸性肝炎等疾病[2－3］，其主要成分為黃酮類物質(zhì)。槲皮素是廣金錢草中主要的黃酮類物質(zhì)，化學(xué)名稱是3，3′，4′，5，7－五羥基黃酮，具有消炎、抗病毒、抗氧化、降糖降壓、保護心血管等藥理功能和生物活性[4－5］，能抑制多種腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[6－7］。然而槲皮素水溶性差，生物利用率低，導(dǎo)致其在醫(yī)學(xué)和保健領(lǐng)域的應(yīng)用受到極大限制[8］。槲皮素與牛血清白蛋白相互作用會影響槲皮素的抗氧化性[9］。Rawel等[10］發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白與槲皮素的相互作用對其熱穩(wěn)定性有益。β－乳球蛋白存在于大多數(shù)哺乳動物的乳汁中[11－12］，是乳清蛋白的主要成分，有較強的配體結(jié)合能力，可以作為優(yōu)良的生物相容性載體材料[13－14］。研究β－乳球蛋白與槲皮素的相互作用對深入研究藥物活性物質(zhì)的有效活性和配伍關(guān)系、開發(fā)其在健康保健領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

電噴霧電離（ESI）是一種軟電離技術(shù)，能夠保持生物大分子的結(jié)構(gòu)和生物功能，被廣泛應(yīng)用于非共價鍵作用的研究，尤其是蛋白質(zhì)與配體小分子的相互作用，具有快速高效、高靈敏度、高精確度、易于推導(dǎo)出化合物的化學(xué)計量比等優(yōu)點[15－17］。作者采用電噴霧質(zhì)譜法研究了β－乳球蛋白與槲皮素的相互作用，探索了兩者結(jié)合的反應(yīng)條件，分析了兩者發(fā)生結(jié)合的可能性與結(jié)合程度，擬為深入了解藥物中槲皮素和β－乳球蛋白的藥效作用提供實驗依據(jù)和新的思路。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

廣金錢草（產(chǎn)地：廣東），粉碎過篩，備用。

槲皮素（純度≥98%）、超純水（18.25MΩ）、乙酸銨（分析純），阿拉丁試劑有限公司；β－乳球蛋白（18 277Da，純 度 ≥90%），Sigma公司；乙 醇 （分 析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Agilent LC－Q－TOF－MS 6520型液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，美國安捷倫公司；KQ－250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHZ－03型高精度數(shù)控搖床，上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司。

1.2 廣金錢草提取液的制備與表征

準確稱取10g廣金錢草粉末裝入帶塞三口燒瓶中，加入100mL70%乙醇溶液，室溫浸泡3h后超聲提取1h，90℃加熱回流2h，冷卻，取3mL提取液置于離心管中，1 000r·min－1離心20min，取上層清液10μL稀釋100倍，稀釋液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，取濾液進樣。

色譜條件：C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫40℃；流速0.2mL·min－1；梯度洗脫條件見表1 ；進樣量2μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負離子檢測模式，離子掃描范圍（m／z）200～1 000；干燥氣溫度300℃；干燥氣流速10L·min－1；霧化器壓力206.8 kPa；毛細管電壓3 500V；碎裂電壓125V。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution condition

1.3 槲皮素與β－乳球蛋白混合溶液的配制

配制pH＝7.4的乙酸銨緩沖液，備用。將β－乳球蛋白用乙酸銨緩沖液（pH＝7.4）配制成濃度為100 μmol·L－1的溶液，置于4℃下備用。β－乳球蛋白和槲皮素混合溶液按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的不同濃度比進行配制，最終蛋白質(zhì)在各溶液里的濃度為5μmol·L－1。

1.4 β－乳球蛋白與槲皮素的相互作用研究

儀器條件：β－乳球蛋白與槲皮素的相互作用在ESI－Q－TOF－MS正離子模式下進行檢測，待測樣品由自動進樣器以標準方式進樣。液相色譜的流動相為100%的超純水，進樣量為30μL，流速為0.05mL·min－1。電噴霧質(zhì)譜條件：干燥氣溫度200℃；干燥氣流速10L·min－1；噴霧器壓力172.4kPa；毛細管電壓3 500V；碎裂電壓175V；質(zhì)譜采集范圍（m／z）1 000～3 200。

樣品的孵育與檢測：將按1.3方法配制好的不同濃度比的β－乳球蛋白與槲皮素的混合溶液置于25℃恒溫箱中孵育45min，然后在上述儀器條件下進行檢測，得到各濃度比的β－乳球蛋白與槲皮素相互作用的質(zhì)譜圖與去卷積質(zhì)譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮類物質(zhì)的定性分析

對廣金錢草提取液進行負離子模式分析，以其中的槲皮素為例，其提取離子色譜圖和質(zhì)譜圖見圖1、圖2。

圖1 槲皮素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of quercetin

圖2 槲皮素的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of quercetin

結(jié)合圖1、圖2定性結(jié)果，槲皮素的m／z 301.03827對應(yīng)為[M－H］－，與理論質(zhì)量數(shù)僅相差0.00289，分子式：C16H12O7。

根據(jù)高分辨質(zhì)譜檢測特征離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，共檢測出10種天然黃酮類化合物（表2 ），它們分別為夏佛塔苷、芹菜素、柚皮素、異鼠李素、山奈素、異葒草苷、牡荊素、槲皮素、山奈酚、金絲桃苷和一種有機酸綠原酸（未列入表中）。

2.2 β－乳球蛋白與槲皮素的相互作用

非共價鍵復(fù)合物的質(zhì)荷比位移可通過式（1）計算：

式中：Mwprotein和Mwligand分別是小分子和蛋白質(zhì)的分子量；i是氣相中由正離子模式檢測到的蛋白質(zhì)的電荷價態(tài)；j是單個蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子數(shù)目。

自然態(tài)的β－乳球蛋白有＋7至＋11多電荷峰，信號較強的為＋9與＋8電荷峰，以＋9電荷對應(yīng)的峰對β－乳球蛋白及其復(fù)合物進行研究。β－乳球蛋白的質(zhì)量數(shù)是18 277Da，＋9多電荷峰中蛋白質(zhì)的質(zhì)量數(shù)是2 031.7Da，槲皮素的質(zhì)量數(shù)是302Da，因此，在β－乳球蛋白的＋9多電荷峰中小分子的質(zhì)量數(shù)位移為33.5 Da，如圖3所示。

表2 廣金錢草中黃酮類物質(zhì)的定性分析Tab.2 Qualitative analysis of flavonoids of Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.

圖3 β－乳球蛋白與槲皮素在不同濃度比時相互作用的質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectra of the interaction between β－lactoglobulin and quercetin at different concentration ratios

由圖3可知，β－乳球蛋白能夠與槲皮素結(jié)合，且結(jié)合數(shù)目隨著濃度比的增大而不斷增加，在1∶10的濃度比時，結(jié)合配體分子的數(shù)目最多，單個β－乳球蛋白最多能夠結(jié)合6個槲皮素小分子。

為了進一步研究β－乳球蛋白與槲皮素結(jié)合能力的強弱，將上述質(zhì)譜圖通過去卷積得到了去卷積質(zhì)譜圖，見圖4。

β－乳球蛋白的質(zhì)量數(shù)是18 277Da，槲皮素質(zhì)量數(shù)是302Da，從圖4可以看出，當(dāng)復(fù)合物的質(zhì)量數(shù)是18 579Da、18 881Da、19 183Da、19 485Da、19 787 Da、20 089Da時，分別結(jié)合了1、2、3、4、5、6個槲皮素小分子。

圖4 β－乳球蛋白與槲皮素在不同濃度比時相互作用的去卷積質(zhì)譜圖Fig.4 The deconvoluted mass spectra of quercetin binding to β－lactoglobulin at different concentration ratios

乳制品中的乳糖作為還原糖，通?？膳c少量β－乳球蛋白發(fā)生美拉德反應(yīng)，對蛋白質(zhì)的活性有抑制作用，反應(yīng)中間產(chǎn)物為乳果糖基賴氨酸，質(zhì)量數(shù)比β－乳球蛋白增加324Da[18］，對應(yīng)的離子峰為2 067.7Da。由圖3可見，在高濃度比時，槲皮素與β－乳球蛋白的結(jié)合能力比乳糖強，美拉德產(chǎn)物對應(yīng)的離子峰強度逐漸降低，槲皮素一定程度上抑制了β－乳球蛋白與乳糖的美拉德反應(yīng)。

2.3 β－乳球蛋白與槲皮素相互作用的結(jié)合常數(shù)

采用式（2）～（5）計算β－乳球蛋白與槲皮素相互作用的結(jié)合常數(shù)[19－21］。

Rj代表復(fù)合物濃度與未結(jié)合配體的蛋白質(zhì)的濃度之比。

[L］是溶液平衡態(tài)時的自由小分子濃度，可由式（4）計算：

[P0］是蛋白質(zhì)總濃度，[L0］是配體小分子總濃度。所以式（3）又可寫成：

由于復(fù)合物濃度以及蛋白質(zhì)濃度與質(zhì)譜圖中離子的信號強度成正比，故其濃度比Rj可以由去卷積質(zhì)譜圖中相應(yīng)峰的豐度比來表示，代入式（5）即可計算得到不同濃度比時的結(jié)合常數(shù)，結(jié)果見表3 。

表3 β－乳球蛋白與槲皮素在不同濃度比時的結(jié)合常數(shù)Tab.3 Binding constants of quercetin binding to β－lactoglobulin at different concentration ratios

由表3 可知，隨著濃度比的增大，單個β－乳球蛋白能結(jié)合的槲皮素數(shù)目持續(xù)增加，當(dāng)濃度比為1∶10時，單個β－乳球蛋白分子可以結(jié)合6個槲皮素分子，結(jié)合常數(shù)數(shù)量級為104，結(jié)合效果良好。

3 結(jié)論

利用高效液相色譜－質(zhì)譜技術(shù)檢測出了廣金錢草中10種黃酮類化合物，通過ESI－Q－TOF－MS方法快速直觀地研究了槲皮素和β－乳球蛋白的相互作用，計算得到了不同濃度比時β－乳球蛋白與槲皮素的結(jié)合數(shù)目和結(jié)合常數(shù)。高濃度的槲皮素可以抑制β－乳球蛋白與乳糖的美拉德反應(yīng)，提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。由于β－乳球蛋白的生物相容性好，與其結(jié)合有可能提高槲皮素的生物利用率、增強保健功效。研究β－乳球蛋白與槲皮素的作用，為探索蛋白質(zhì)大分子與黃酮類小分子的相互作用提供了實驗依據(jù)，黃酮與蛋白質(zhì)的非共價作用可為改善藥物的配伍和給藥方式提供參考。

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