王婉冰，徐子恒，王宏軍，岳茹鳳

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化海蓬子外種皮水溶性多糖提取工藝及其抗菌活性

王婉冰，徐子恒，王宏軍*，岳茹鳳

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

對海蓬子外種皮多糖提取工藝進(jìn)行研究，以干枯的海蓬子外種皮為原料，水提醇沉法獲得多糖，考察提取時間、提取溫度、料液比對多糖提取量的影響，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對影響海蓬子外種皮多糖提取量的主要因素進(jìn)行分析優(yōu)化，微孔-平板法測定粗多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。結(jié)果表明：影響海蓬子外種皮多糖提取量工藝的因素按主次順序排列為提取溫度＞料液比＞提取時間；確定海蓬子外種皮多糖水提取的最佳工藝條件為提取溫度87 ℃、提取時間5 h、料液比1∶57（g/mL），在該條件下，海蓬子外種皮多糖的提取量為（13.03±0.63） mg/g，與預(yù)測值12.42 mg/g接近，粗多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值分別為50、100 mg/mL，由此表明，響應(yīng)面模型與實(shí)際情況擬合良好，能較好地預(yù)測海蓬子外種皮多糖的提取量，海蓬子外種皮粗多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑制作用。

海蓬子；外種皮；多糖；提取工藝；響應(yīng)面法；抗菌活性

海蓬子（Salicornia bigelovii Torr.）屬藜科鹽角草屬植物，該屬在全世界分布，在國內(nèi)分布于華北、西北和遼寧、山東、江蘇等地。海蓬子生于鹽堿地、鹽湖邊及海邊等潮濕的重鹽質(zhì)土壤上，該植物富含膳食纖維、各種維生素、不飽和脂肪酸、人體所必需的18 種氨基酸及微量元素鈣、鐵、鋅、碘等海洋礦物質(zhì)［1-2］。海蓬子是有益人體的綠色保健食品，也是生物鹽、藥用化工的原料。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，鹽角草屬植物的黃酮類化合物異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和兩個綠原酸衍生物（MDQ、CDCQ）具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降糖、降血脂等作用［3-7］，多糖能夠起到調(diào)節(jié)免疫、抗炎和抗腫瘤作用［8-10］。海蓬子可用于治療癌癥、糖尿病、肥胖癥和便秘等多種疾?。?1-12］。關(guān)于海蓬子鮮嫩全草研究較多，主要涉及黃酮類、總生物堿、皂苷、食用生物鹽方面的提取及活性研究［13-16］，亦有報(bào)道海蓬子嫩莖中多糖提取工藝及多糖成分［17-18］；對海蓬子種子的研究不多，主要涉及脂肪酸及亞油酸活性的研究［19-20］；外種皮相關(guān)研究較少，外種皮中多糖研究暫未見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)以遼寧錦州沿海野生海蓬子為研究對象，對其成熟后的外種皮多糖提取及抗菌活性進(jìn)行初步研究，為其進(jìn)一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

海蓬子采自遼寧錦州白沙灣灘涂，采集時間為2013年10—11月，經(jīng)遼寧醫(yī)學(xué)院水生物專家王宏副教授鑒定。采集海蓬子除雜去沙，取外種皮及種籽，過40 目篩，洗凈，50～60 ℃烘箱干燥，密封常溫保存，備用。

無水乙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；葡萄糖 天津市南開大學(xué)精細(xì)化工股份有限公司；木糖、蒽酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；半乳糖 上海市惠世生化試劑有限公司；濃硫酸 錦州古城化學(xué)試劑廠；營養(yǎng)瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；金黃色葡萄球菌（CVCC1882）、大腸桿菌（CVCC251） 中國獸藥監(jiān)察所；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Costar公司。

1.2儀器與設(shè)備

UV-757CRT分光光度計(jì) 上海三精科有限公司；FA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學(xué)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 常州國華儀器有限公司；TDL-5000B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF6050真空干燥箱、隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的半乳糖、葡萄糖、木糖各10 mg，混勻后用蒸餾水溶解并定容至100 mL備用。量取混標(biāo)糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于具塞試管中，加水至1.0 mL，蒽酮-硫酸比色法測定吸光度（A）［21］，擬合線性回歸方程。

1.3.2海蓬子外種皮多糖提取的單因素試驗(yàn)

采用水提醇沉法提取粗多糖［17，22］。稱取等量（10 g）海蓬子外種皮若干份，對其進(jìn)行提取溫度、提取時間、料液比的單因素試驗(yàn)。先固定其中2 個因素水平，考察另外1個因素不同水平對多糖提取量的影響。固定料液比為1∶48，置于90 ℃水浴中，分別浸提2、3、4、5、6 h，考察提取時間對多糖提取量的影響；固定料液比1∶48、提取時間4 h，置于60、70、80、90、100 ℃水浴中，考察提取溫度對多糖提取量的影響；固定提取溫度90 ℃、提取時間4 h，分別加水150、300、450、600、750 mL，考察料液比對多糖提取量的影響。

1.3.3多糖提取量的測定

精確稱取提取物，用蒽酮-硫酸比色法測定吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，得其多糖含量，多糖提取量按下式計(jì)算。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案［23］，因素水平見表1，以多糖提取量（Y）為響應(yīng)值，用Disign-Expert 7.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析建立數(shù)學(xué)模型，以確定海蓬子外種皮多糖的最佳提取條件。

表1　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table1　Factors and coded levels used in Box-Behnken design

1.3.5最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定

精密稱取粗多糖4.0 g，用蒸餾水溶解，于10 mL容量瓶中定容，濾過除菌?；罹?jì)數(shù)法測定細(xì)菌濃度，用營養(yǎng)肉湯將細(xì)菌濃度調(diào)至104CFU/mL［24］。取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL營養(yǎng)肉湯，第1孔加入100 μL粗多糖溶液，混勻后進(jìn)行二倍比稀釋至第8孔，然后每孔加入50 μL菌懸液，第9孔做細(xì)菌對照，第10孔做粗多糖溶液對照，37 ℃培養(yǎng)18 h，接種環(huán)取各孔液體涂于平板上，37 ℃再培養(yǎng)12 h，以平板上無細(xì)菌生長或生長菌落數(shù)小于3個對應(yīng)的多糖稀釋度定為MIC，該法稱為微孔-平板法，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)通過Disign-Expert 7.0軟件進(jìn)行計(jì)算和分析處理，系數(shù)的顯著性通過方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

對不同質(zhì)量濃度混標(biāo)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與對應(yīng)的吸光度，擬合線性方程為A=0.086C+0.006 6，R2=0.999 7。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1提取溫度對多糖提取量的影響

圖1　提取溫度對多糖提取量的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa

由圖1可知，多糖提取量隨提取溫度的升高而大幅升高，當(dāng)提取溫度達(dá)到90 ℃時，提取量為最大值10.53 mg/g，當(dāng)提取溫度達(dá)到100 ℃時，提取量略有下降趨勢，這與高溫會使多糖分解，導(dǎo)致分離過程中損耗有關(guān)，所以適宜提取溫度最優(yōu)水平為90 ℃。

2.2.2提取時間對多糖提取量的影響

圖2　提取時間對多糖提取量的影響Fig.2　Effect of extraction time on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa

由圖2可知，隨著提取時間的延長多糖提取量大幅上升，提取時間達(dá)到5 h時，提取量達(dá)到最大值11.14 mg/g，提取時間超過5 h，提取量明顯下降，故提取時間最優(yōu)水平為5 h。

2.2.3料液比對多糖提取量的影響

由圖3可知，隨著溶劑用量的增加多糖提取量逐漸增多，在1∶60時達(dá)到最大值11.16 mg/g，當(dāng)溶劑用量繼續(xù)加大后提取量顯示下降的趨勢，所以料液比最優(yōu)水平為1∶60。

圖3　料液比對多糖提取量的影響Fig.3　Effect of solid to liquid radio on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化確定最佳提取條件

2.3.1模型建立及顯著性檢驗(yàn)

通過對提取時間、料液比、提取溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)獲得海蓬子外種皮多糖提取量試驗(yàn)值（表2），試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Disign-Expert 7.0軟件進(jìn)行多元線性回歸分析得到相應(yīng)的二次方程模型：Y=14.68+2.42A－0.071B－0.74C－0.39AB－0.9AC+0.055BC－3.39A2－1.69B2－1.47C2。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2　Box-Behnken experimental design with experimental and predicted values of crude polysaccharide yield

表3　回歸方程模型方差分析表Table3　Analysis of variance for the developed regression equation

響應(yīng)面分析中對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬和的二次模型方差分析見表3，回歸F值為33.85，多元相關(guān)系數(shù)為R2=98.39%，預(yù)測R2=75.92%，調(diào)整R2=95.48%，且失擬不顯著，回歸是顯著的，說明模型對試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好；P=0.000 6，表明該模型高度顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值的預(yù)測，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)（表4）表明：因素A對提取效果的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01），因素C對提取效果的線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），因素B對提取效果的線性效應(yīng)不顯著（P＞0.05）；因素A2、B2、C2對提取效果的曲面效應(yīng)極顯著（P＜0.01）；因素AC對提取效果的交互影響顯著（P＜0.05），因素AB、BC對提取效果的交互影響不顯著（P＞0.05）。說明3 個因素均不同程度的對響應(yīng)值產(chǎn)生顯著或極顯著的影響，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素選擇是成功的。

表4　回歸方程系數(shù)顯著性分析Table4　Significance test for each regression coefficient of the developed regression equatiioonn

2.3.2多糖提取量響應(yīng)面分析與優(yōu)化

運(yùn)用Disign-Expert 7.0軟件所做的響應(yīng)面圖（圖4）可對任何兩因素交互影響海蓬子外種皮多糖的提取量進(jìn)行分析與評價(jià)，以確定最佳因素水平范圍。

圖4　各兩因素交互影響海蓬子外種皮多糖提取量的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface plot showing the effects of extraction time，extraction temperature and solid to liquid ratio on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa

圖4a顯示了料液比在1∶50（g/mL）條件下，提取溫度和提取時間對海蓬子外種皮多糖提取量的交互影響。在提取時間不變的條件下，隨著提取溫度的逐漸升高，提取量呈現(xiàn)迅速上升、達(dá)到峰值平緩下降的趨勢。當(dāng)提取溫度在低水平條件下，提取量變化較明顯；在高水平條件下，提取量逐漸降低。在提取溫度不變的條件下，隨著提取時間的逐漸延長，提取量變化不明顯。所以當(dāng)提取時間處于高水平時，可以獲得很高的提取量，而提取時間處于中間水平時，可以獲得較高的提取量。

圖4b顯示了提取時間為5 h時，提取溫度和料液比對多糖提取量的交互影響。在料液比不變的條件下，隨著提取溫度的逐漸升高，提取量出現(xiàn)明顯上升的趨勢，超過90 ℃時提取量呈現(xiàn)平緩下降趨勢。在提取溫度不變的條件下，隨著料液比水平的逐漸增加，提取量呈現(xiàn)平緩升高趨勢。溫度的升高可以加速熱運(yùn)動，使水溶性多糖得到更充分地釋放。所以海蓬子外種皮多糖提取關(guān)鍵因素是提取溫度，其處于較高水平、料液比適宜即可獲得較高的提取量。

圖4c顯示了提取溫度在90 ℃條件下，提取時間和料液比對多糖提取量的交互影響。在提取時間不變的條件下，隨著料液比水平的逐漸增加，提取量呈現(xiàn)急速上升之后又迅速下降的趨勢；在料液比不變的條件下，隨著提取時間的逐漸延長，提取量也呈現(xiàn)急速上升之后又迅速下降的趨勢，并且變化較大。由此表明，提取時間和料液比交互作用對多糖提取量影響顯著。

經(jīng)Disign-Expert 7.0軟件分析A、B、C的代碼值為－0.51、－0.21、－0.34，對應(yīng)的實(shí)際值為87.45 ℃、4.79 h、1∶56.6，考慮到實(shí)際操作，最后確定最優(yōu)提取工藝為提取溫度87 ℃、提取時間5 h、料液比1∶57（g/mL），理論計(jì)算提取量達(dá)到12.42 mg/g。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，海蓬子外種皮多糖提取量為（13.03±0.63）mg/g，與模型預(yù)測值的比較誤差為4.91%，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.4 多糖抗菌活性

海蓬子外種皮粗多糖對金黃色葡萄球菌的MIC值為50 mg/mL，對大腸桿菌的MIC值為100 mg/mL。由此表明，海蓬子外種皮粗多糖具有抗菌活性，且抗金黃色葡萄球菌的活性優(yōu)于大腸桿菌。

3　結(jié) 論

本研究采用水提醇沉法從海蓬子外種皮中提取多糖，為進(jìn)一步優(yōu)化提取多糖工藝參數(shù)，本實(shí)驗(yàn)考察了提取時間、提取溫度、料液比3 個因素對多糖提取量的影響。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，影響海蓬子外種皮多糖提取量的主次順序排列為提取溫度＞料液比＞提取時間，海蓬子外種皮多糖水提取工藝條件為提取溫度87 ℃、提取時間5 h、料液比1∶57（g/mL），在該條件下海蓬子外種皮多糖的提取量為（13.03±0.63）mg/g。海蓬子外種皮粗多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抗菌活性。

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Optimization of Extraction and Antimicrobial Activity of Water-Soluble Polysaccharides from Salicornia bigelovii Torr. Testa

WANG Wanbing， XU Ziheng， WANG Hongjun*， YUE Rufeng
（College of Animal Husbandry and Veterinary， Liaoning Medical University， Jinzhou 121001， China）

A water extraction-alcohol precipitation method to extract water-soluble polysaccharides from the dry testa of Salicornia bigelovii Torr. was developed in this study. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as a function of extraction time， extraction temperature and solid to solvent ratio using combination of one-factor-ata-time experiments and response surface methodology. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of crude polysaccharides from S. bigelovii Torr. testa against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were detected by microwell plate method. The results showed that polysaccharide yield was affected in decreasing order by the three factors： extraction temperature， solid to liquid ratio and extraction time. An extraction temperature of 87 ℃， a solid to liquid ratio of 1：57 （g/mL） and 5 h extraction proved optimal. Experiments carried out under the optimized conditions led to an extraction yield of （13.03 ± 0.63） mg/g， agreeing with the predicted value （12.42 mg/g）， indicating that the response surface model has good prediction ability for the extraction of polysaccharides from the testa of Salicornia bigelovii Torr.. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of the crude polysaccharides against S. aureus and E. coli were 50 and 100 mg/mL， respectively， suggesting potent antibacterial activity.

Salicornia bigelovii Torr.； testa； polysaccharide； extraction； response surface analysis； antimicrobial activity

Q946.3；TS201.2

A

1002-6630（2015）14-0005-05

10.7506/spkx1002-6630-201514002

2014-11-26

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201951）；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310160035）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LJQ2013087）；遼寧醫(yī)學(xué)院奧鴻大學(xué)生科技活動基金項(xiàng)目（2013D035）

王婉冰（1993—），女，本科生，研究方向?yàn)閯游镝t(yī)學(xué)。E-mail：393873735@qq.com

王宏軍（1977—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)及藥理活性。E-mail：lnwhj2012@163.com