周穎等

摘要：采集武漢市各大農(nóng)貿市場52份小龍蝦（即克氏原螯蝦，Procambarus clarkii）樣品，利用1%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）和TCBS對小龍蝦樣品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）進行分離和初步鑒定，用PCR擴增副溶血性弧菌具有種特異性的tl基因來驗證疑似菌株。PCR檢測方法共檢出14株副溶血性弧菌，檢出率為26.92%。在小龍蝦中分離得到的14株副溶血性弧菌，對其進行基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位點序列分型。其中dtdS的多態(tài)性位點比例均高于其他6個基因，為5.2%。7個基因串聯(lián)后將14株副溶血性弧菌分為12個序列型，其中7株序列型未知，分辨力達0.967?？芍錆h市市售淡水小龍蝦中副溶血性弧菌呈現(xiàn)出較大的多樣性。Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹將分離得到的14株副溶血性弧菌分為2個群，VP2、VP13、VP7和VP14同屬一個群，其他10株則屬于另外一個群。其中VP13和已知的臨床分離株ST3在進化樹上表現(xiàn)出較高的親緣性（69%）。

關鍵詞：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；小龍蝦（Procambarus clarkii）；多位點序列分型；系統(tǒng)進化樹

中圖分類號：S852.61；S966.12 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）18-4548-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.039

湖北省水產(chǎn)品產(chǎn)值約占到農(nóng)業(yè)的20%，淡水產(chǎn)品總產(chǎn)量連續(xù)16年在中國排名第一。其中，淡水小龍蝦出口一直是中國出口最多的省份，約占中國出口總量的50.6%[1]。小龍蝦學名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）[2]，也叫淡水小龍蝦。小龍蝦的養(yǎng)殖主要分布于池塘、溝渠等地區(qū)，受生長環(huán)境的影響，蝦體內可能寄生多種病原微生物，易通過交叉污染其他農(nóng)產(chǎn)品，對消費者健康造成威脅。而且在出口方面，淡水產(chǎn)品常因微生物超標導致淡水產(chǎn)品不合格而影響了產(chǎn)品的對外信譽，嚴重阻礙了湖北省整個水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是革蘭氏陰性嗜鹽菌，隸屬弧菌科弧菌屬，它是一種典型的人獸共患病菌，也是一種常見的引起食物中毒的病原菌[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，自1997年以來，副溶血弧菌病的發(fā)生呈持續(xù)上升趨勢。1992～2001年國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，發(fā)生的微生物食源性疾病中由副溶血弧菌引起的病例數(shù)占首位（31.1%）[4，5]，可知副溶血性弧菌對公共衛(wèi)生已經(jīng)構成嚴重威脅。雖然副溶血性弧菌為嗜鹽菌，但近期在淡水小龍蝦產(chǎn)品中分離率很高。人若食用這些未煮熟的產(chǎn)品可發(fā)生食物中毒、胃腸炎、反應性關節(jié)炎及敗血癥等[6]。對病原微生物進行準確種群分布與分型研究是探討其致病性、流行性、變異性、耐藥性等特征和建立快速檢測、鑒定與控制技術的關鍵[7]。因此，開展副溶血性弧菌流行特征和溯源性的分型研究對預防食源性副溶血弧菌病的流行具有十分重要的意義。多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是一種用于種群的遺傳分析的分型技術，不同于常規(guī)的微生物種群生物學分型技術，是近年來發(fā)展很快的分子生物學分析方法[8]。MLST分辨力很高，結果易于被驗證、電子保存、可在全球范圍內實現(xiàn)數(shù)據(jù)交流與共享，且材料易于獲得，只需制備細菌DNA或是死細胞懸液，無需培養(yǎng)病原菌[9]。MLST系統(tǒng)因結合了序列測定的高通量特性和已建立的群體遺傳學技術，具有方便、可重復性、可測性等特點而越來越多的被作為國際間菌株比較的常用工具[10]。

本試驗利用堿性蛋白胨水（APW）增菌液、TCBS選擇培養(yǎng)基及PCR檢測方法對武漢市市售淡水小龍蝦中副溶血弧菌進行分離鑒定，并基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA 7個管家基因串聯(lián)對分離到的菌株進行多位點序列分型，通過分析分離株間的親緣關系，以推斷其變異性，確定食品污染的病原菌及各種信息，對控制副溶血性弧菌的食源性污染有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

副溶血弧菌標準菌株（ATCC33846）由上海交通大學史賢明教授饋贈。小龍蝦樣品于武漢市各大農(nóng)貿市場采集，樣品共52份。

1.2 試劑與儀器

蛋白胨購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，TSB與TCBS瓊脂購自青島高科園海博生物技術有限公司，瓊脂粉購自北京奧博星生物技術有限公司，Taq DNA polymerase、DNA Ladder Marker、dNTP、10×PCR Buffer購自北京全氏金生物技術有限公司，NaCl等其他試劑產(chǎn)自國藥集團化學試劑有限公司。

5414型高速冷凍離心機（德國艾本德股份公司）；Model MG96+PCR儀（鄭州比朗儀器有限公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 小龍蝦樣品中副溶血性弧菌的培養(yǎng) 樣品中副溶血性弧菌的分離鑒定參照GB/T 4789.7-2008，將小龍蝦樣品剪碎后放入1%氯化鈉堿性蛋白胨水中增菌培養(yǎng)后，接種到TCBS培養(yǎng)基上劃線分離，挑取TCBS培養(yǎng)基上藍綠色、圓形、直徑為2～3 mm、觸摸有口香糖質感的疑似菌落，接種到含1%氯化鈉的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上純化培養(yǎng)。

1.3.2 基因組的提取 DNA提取采用水煮法。取細菌純培養(yǎng)物1 mL 10 000 r/min離心5 min，加入100 μL無菌水，使菌液懸浮后于100 ℃水浴10 min，冰浴5 min，10 000 r/min離心4 min，上清液儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?

1.3.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表tl、dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC和tnaA序列用DNA Star軟件設計8對引物，由上海英駿生物技術有限公司合成。引物序列與目的片段長度見表1。

1.3.4 PCR驗證試驗 對疑似菌株用PCR擴增VP具有種特異性的tl基因，來驗證所分離菌株。PCR體系共25 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL；擴增條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共25個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用110 V電壓，0.8%瓊脂糖凝膠電泳35 min后檢測。

1.3.5 管家基因的擴增及其產(chǎn)物測序 PCR體系共25 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL；擴增條件：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用110 V電壓，0.8%瓊脂糖凝膠電泳35 min后檢測。檢測正確后將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司武漢測序部測序。

1.3.6 多位點序列分型 登錄國際多位點序列分型數(shù)據(jù)庫（http：//pubmlst. org/vparahaemolyticus/），將本試驗獲得的14株副溶血弧菌的7個管家基因測序結果與數(shù)據(jù)庫已知信息進行比對，以獲取菌株的等位基因編號。將已得菌株的7個基因的編號與數(shù)據(jù)庫已知信息進行比對，獲取菌株的序列型。

1.3.7 多態(tài)性分析及系統(tǒng)進化樹的制作 使用MEGA5.03軟件進行多態(tài)性分析，分析包括等位基因數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、GC含量以及同義突變（dS）與非同義突變（dN）。各基因的分辨力（Discrimination Index，DI）按以下公式計算[11]（N代表分析的菌株數(shù)，j代表等位基因型數(shù)目，nj代表某一等位基因型的菌株數(shù)）：

DI=1-■■nj（nj-1）

使用MEGA5.03中的Neighbor-joining法將14株分離株與已知的臨床分離株ST3、ST8和ST120[12]一同構建系統(tǒng)進化樹，比較其親緣關系。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌分離鑒定結果

將52份淡水小龍蝦增菌液劃線于TCBS選擇培養(yǎng)基上，共得到藍綠色疑似菌落41份。

2.2 PCR驗證試驗及檢出率

疑似分離菌株的tl基因擴增結果表明，有14株為陽性，出現(xiàn)特異性目標條帶，其余均為陰性。得淡水小龍蝦中副溶血性弧菌的檢出率為26.92%。擴增結果見圖1。

2.3 副溶血性弧菌的多位點序列分型

dnaE基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為11個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于dnaE-111型，其他菌株各成一個等位基因型；gyrB基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為10個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于gyrB-239型，菌株VP7和VP8屬于gyrB-92型，其他菌株各成一個等位基因型；recA基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為10個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4、VP8與VP10屬于recA-31型，其他菌株各成一個等位基因型；dtdS基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為11個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于dtdS-195型，其他菌株各成一個等位基因型；pntA基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為10個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于pntA-24型，菌株VP2和VP7屬于pntA-54型，其他菌株各成一個等位基因型；pyrC基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為10個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于pyrC-173型，菌株VP2和VP13屬于pyrC-11型，其他菌株各成一個等位基因型；tnaA基因可將14株副溶血性弧菌海產(chǎn)品分離株分為9個等位基因型，其中菌株VP1、VP3、VP4與VP6屬于tnaA-14型，菌株VP7、VP8和VP11屬于tnaA-24型，其他菌株各成一個等位基因型。綜合上述7個管家基因的多位點序列分型結果，可將14株副溶血性弧菌分為12個序列型，其中VP1、VP3和VP4屬于同一序列型（ST446），其他菌株均各成一個序列型（表2）。且在分離得到的14株副溶血弧菌中有7株數(shù)據(jù)庫中未收錄，為未知序列型。

2.4 dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC、tnaA的多態(tài)性分析

在分離得到的14株副溶血弧菌中recA基因和dtdS基因的多態(tài)位點數(shù)最多（表3），達24個，其中dtdS基因的多態(tài)位點比例最高，為5.2%。pntA基因和tnaA基因發(fā)生同義突變的概率大于發(fā)生非同義突變的概率，而其他基因則反之。其中pntA基因發(fā)生非同義突變的概率為0，dnaE基因發(fā)生同義突變的概率為0。將7個管家基因串聯(lián)后，多態(tài)位點比例為2.7%，可分辨出12個序列型，分辨率可達0.967。

2.5 系統(tǒng)進化樹

利用MEGA5.03軟件中的Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)進化樹見圖2，分離到的14株副溶血性弧菌被分為2個群，VP2、VP7、VP13、VP14和ST3、ST8同屬一個群，其他10株和ST120則屬于另外一個群。其中VP1、VP3和VP4屬于同一序列型，VP6雖然與其不屬于同一序列型，但是它們在進化樹上表現(xiàn)出高度的親緣性（100%）。VP13和已知的臨床分離株ST3在進化樹上也表現(xiàn)出較高的親緣性（69%）。

3 結論

本試驗對52份武漢市市售淡水小龍蝦中的副溶血性弧菌進行分離鑒定，共得到了14株副溶血性弧菌，VP檢出率為26.92%。雖然副溶血性弧菌為嗜鹽菌，但其在淡水小龍蝦中的檢出率也很高?？赡苁丘B(yǎng)殖及銷售條件粗放，市場銷售過程中交叉污染導致。在使用淡水產(chǎn)品時也要保持高度警惕，不生食，熟制徹底后方可食用。利用多位點序列分型對分離株進行分型，可得到12個序列型，其中7個序列型在數(shù)據(jù)庫中未收錄，為未知序列型?？梢姡↓埼r中的副溶血性弧菌呈現(xiàn)出較大的多樣性。這表明淡水小龍蝦在養(yǎng)殖過程中的污染途徑不單一，存在交叉污染的風險。通過Neighbor-joining法繪制系統(tǒng)進化樹，可知雖然VP6雖然與VP1、VP3和VP4不屬于同一序列型，但是它們在進化樹上表現(xiàn)出高度的親緣性（100%），故推測VP6與VP1、VP3和VP4來自于單一克隆，經(jīng)歷低水平的分子變異而來。且進化樹中各菌株之間的親緣關系不是很高，故推測都存在不同程度的分子變異，而這也有可能是造成淡水小龍蝦中副溶血性弧菌檢出率高的另一原因。值得注意的是，其中VP13和已知的臨床分離株ST3在進化樹上表現(xiàn)出較高的親緣性（69%），故此類菌株對公共衛(wèi)生造成的威脅較大，易引起食物中毒。因此，副溶血性弧菌對淡水小龍蝦養(yǎng)殖業(yè)以及廣大消費者所引起的公共衛(wèi)生的潛在威脅和風險都不容小視[13-16]。故應在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)建立病原菌檢測體系，以預防食源性疾病的發(fā)生。

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