林曉林等

摘要：通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)水稻（Oryza sativa L.）蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動(dòng)子序列和表達(dá)特性進(jìn)行了分析；通過(guò)構(gòu)建OsCER4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS融合表達(dá)載體，分析了OsCER4基因的時(shí)空表達(dá)；并分別以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1.0% H2O2處理水稻幼苗，通過(guò)半定量RT-PCR分析逆境脅迫下OsCER4的表達(dá)模式。啟動(dòng)子序列分析表明，OsCER4啟動(dòng)子中包括大量根、莖、葉肉等特異表達(dá)位點(diǎn)以及與干旱、冷、鹽等多種逆境脅迫相關(guān)的調(diào)控序列。表達(dá)特征分析表明，OsCER4基因在愈傷組織、根、莖、葉中均有表達(dá)，在穎殼和子房中也有表達(dá)。NaCl和PEG等逆境脅迫下，OsCER4基因表達(dá)量在不同處理時(shí)間有所增加，H2O2脅迫下，OsCER4基因表達(dá)量有所下降。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsCER4基因；啟動(dòng)子；表達(dá)；逆境

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4607-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.056

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，常常會(huì)受到干旱、鹽漬、低溫、病蟲(chóng)害等非生物和生物脅迫因素的影響，其中，水分脅迫是環(huán)境脅迫中最普遍的逆境因子。干旱脅迫嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗旱性已成為植物育種的重要研究方向。在干旱逆境脅迫條件下，植物不僅可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的生理生化變化提高對(duì)干旱脅迫的耐性，如產(chǎn)生滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸以及增加抗氧化能力等。同時(shí)，植物還可以通過(guò)誘導(dǎo)干旱脅迫應(yīng)答基因表達(dá)，產(chǎn)生大量特異蛋白，協(xié)同調(diào)節(jié)植物生理生化而適應(yīng)外部逆境，提高對(duì)干旱的抗性。因此，剖析相關(guān)基因在植物逆境脅迫應(yīng)答中的作用已成為植物分子生物學(xué)和作物抗旱研究的熱點(diǎn)。

所有植物的地上部分表皮細(xì)胞外都覆蓋著角質(zhì)層，角質(zhì)層由最外層的上表皮蠟質(zhì)層和角質(zhì)膜層組成，其主要功能是防止植物水分損失[1]，同時(shí)也是抵御外源物質(zhì)滲入和微生物入侵的有效屏障[2]。多個(gè)與蠟質(zhì)相關(guān)的基因已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中被相繼發(fā)現(xiàn)[3-10]，烷類合成相關(guān)的蠟質(zhì)基因CER1在干旱脅迫條件下表達(dá)量顯著增加[5]，而過(guò)表達(dá)CER1基因提高了植株抗逆性[6]。擬南芥角質(zhì)層蠟質(zhì)和角質(zhì)合成的必需基因LACS1和LACS2發(fā)生突變?cè)黾恿酥仓陮?duì)干旱的敏感性[7]；水稻角質(zhì)層蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsGL1-1和OsGL1-2（又命名為WSL2）的突變導(dǎo)致植株葉表面蠟質(zhì)明顯減少，增加了植株干旱敏感性，而過(guò)表達(dá)OsGL1-1基因提高了植株對(duì)干旱的抗性[8-10]。過(guò)表達(dá)苜蓿中克隆的轉(zhuǎn)錄基因WXP1能增加表皮蠟質(zhì)的積累，減少水分的喪失，增加抗旱能力[11]，轉(zhuǎn)WXP1基因的擬南芥耐旱性同樣增加[12]。OsCER4基因與擬南芥CER1基因，水稻OsGL1-1基因和OsGL1-2基因高度同源，屬于脂肪醛脫羧酶（Fatty aldehyde decarbonylase）基因家族成員[13，14]。OsCER4基因（OsGL1-6）主要影響葉表面蠟質(zhì)的合成，OsCER4基因（OsGL1-6）表達(dá)量的下降導(dǎo)致葉表面蠟質(zhì)減少，干旱敏感性增加[15]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4（OsGL1-6）啟動(dòng)子序列和表達(dá)特性進(jìn)行分析，同時(shí)，對(duì)逆境脅迫下OsCER4基因（OsGL1-6）的表達(dá)模式進(jìn)行研究，為闡明OsCER4（OsGL1-6）基因在逆境脅迫下的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻（Oryza sativa L.）品種中花11，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 載體與菌株 pCAMBIA1300G，以pCAMBIA1300與pBI221聯(lián)合改建而成，在pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)上插入了一段CaMV 35S啟動(dòng)子-GUS-終止子的序列，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室提供；大腸桿菌菌株為DH10B；農(nóng)桿菌菌株為EHA105，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑 RNA抽提試劑盒TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄酶（AMV RTase）、RNase inhibitor、Taq DNA聚合酶和dNTP等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；氯仿、無(wú)水乙醇等為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 引物 OsCER4啟動(dòng)子擴(kuò)增引物為OsCER4Gpr（5′-AAAAGGATCCTAGAGGCCATGATAGCTAGC-3′）和OsCER4Gpf （5′-AAAAAAG

CTTGGTTTGGAGATACAATCTGTG-3′）；OsActI擴(kuò)增引物為OsActI-R（5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3′）和OsActI-F（5′-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3′）；OsCER4擴(kuò)增引物為OsCER4-R（5′-TCGTCGTATGGCCGGAATC-3′）和OsCER4-F（5′-GTCATGCAGTTACAGCAGCA-3′）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）對(duì)啟動(dòng)子順式調(diào)控元件進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用RIFGP（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）對(duì)OsCER4表達(dá)的組織器官特異性進(jìn)行分析。

1.2.2 OsCER4啟動(dòng)子表達(dá)分析 以O(shè)sCER4Gpf、OsCER4Gpr為引物，以中花11基因組DNA為模板擴(kuò)增蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動(dòng)子片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共7個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共28個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。以O(shè)sCER4啟動(dòng)子片段替代載體pCAMBIA 1 300中的CaMV35S啟動(dòng)子，重新組裝的載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入水稻中花11[16]。分別取轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織、根、莖、葉、穗子等材料放于固定液（50 mmol/L磷酸緩沖液、1% 甲醛、0.5% Triton-100、pH 7.0）中，抽真空10 min，固定45 min；棄去固定液，加入適量洗液[50 mmol/L 磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、1 mmol/L K3Fe（CN）6，1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空5 min，洗3次；棄去洗液，加入染色液[1 mmol/L磷酸緩沖液、0.5% Triton-100、0.25 mg/mL X-Gluc、1 mmol/L K3Fe（CN）6、1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空15 min，置于37 ℃反應(yīng)過(guò)夜；樣品以70%乙醇進(jìn)行洗滌和保存，并在解剖鏡下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.3 逆境處理 參照Li等[17]方法進(jìn)行，PEG、H2O2和NaCl的濃度分別為12%（M/V），1.0%（V/V），200 mmol/L。

1.2.4 RT-PCR分析 總RNA抽提參照李玲等[18]方法，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Cristina等[19]方法。以O(shè)sActI為內(nèi)參基因，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以O(shè)sCER4-R、OsCER4-F為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4的表達(dá)情況。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 19.05 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsCER4基因啟動(dòng)子的反式作用元件分析

應(yīng)用植物啟動(dòng)子及其反式元件分析在線數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）對(duì)OsCER4啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，OsCER4啟動(dòng)子存在典型的TATA-box和啟動(dòng)子的基本元件CAAT-box以及大量的組織特異表達(dá)核苷酸位點(diǎn)：29個(gè)葉肉特異表達(dá)的CACTFTPPCA1位點(diǎn)，22個(gè)莖特異表達(dá)的位點(diǎn)DOFCOREZM和CCA1ATLHCB1，38個(gè)根特異表達(dá)位點(diǎn)ROOTMOTIFTAPOX1，RHERPATEXPA7，RYREPEATBNNAPA和RAV1AAT；4個(gè)花器發(fā)育相關(guān)元件MYBPLANT和NTBBF1ARROLB。OsCER4啟動(dòng)子也包括大量的與逆境相關(guān)的順式作用元件：早期應(yīng)答脫水脅迫和ABA應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件ACGTABREMOTIFA2OSEM、ABRELATERD1、

ACGTATERD1、ANAERO1CONSENSUS、MYB1AT、MYBCORE、DPBFCOREDCDC3、CATATGGMSAUR、GADOWNAT、MYB1AT、MYCATRD22、MYCATERD1和WRKY71OS以及響應(yīng)高鹽、冷、傷害、病原菌等生物和非生物脅迫的順式元件GT1GMSCAM4、MYCCONSENSUSAT、BIHD1OS、MYBPZM、RAV1AA

T、OSE2ROOTNODULE、WBBOXPCWRKY1、MYBST

1、ELRECOREPCRP1和WBOXNTERF3等；還有響應(yīng)Ca2+信號(hào)、氧化脅迫以及銅離子脅迫相關(guān)的順式作用元件CURECORECR和ABRERATCAL。同時(shí)，還存在外源激素信號(hào)分子生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、水楊酸相關(guān)順式作用元件SURECOREATSULTR11、ARR1AT、CPBCSPOR、WBOXATNPR1和ASF1MOT

IFCAMV等。除了脅迫相關(guān)順式作用元件，還發(fā)現(xiàn)與儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件2SSEEDPROTBANAPA和SEF4MOTIFGM7S；光誘導(dǎo)順式作用元件GATABOX、REALPHALGLHCB21和IBOXCORE/SORLIP1AT以及糖應(yīng)答元件CGACGOSAMY3、WBOXHVISO1、YRIMIDINEBOXOSRAMY1A、TATC

CAYMOTIFOSRAMY3D和MYBGAHV等。通過(guò)啟動(dòng)子順式元件網(wǎng)站的分析預(yù)測(cè)，水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4啟動(dòng)子具有葉、根、莖等組織特異表達(dá)的特性，且存在多個(gè)響應(yīng)生物和非生物逆境脅迫的元件。

2.2 OsCER4基因的表達(dá)分析

通過(guò)水稻基因組芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）分析表明，OsCER4基因主要在幼苗葉、幼苗、子房和胚中表達(dá)，OsCER4基因可能在葉或種子發(fā)育中起作用（表2）。

2.3 OsCER4啟動(dòng)子的表達(dá)分析

從中花11基因組中用引物OsCER4Gpr和OsCER4Gpf擴(kuò)增OsCER4基因的啟動(dòng)子OsCER4P。結(jié)果表明，獲得與預(yù)期大小一致的1 946 bp特異片段（圖1a）。用Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切將OsCER4P啟動(dòng)子片段克隆到pCAMBIA1300G載體中，用OsCER4基因的啟動(dòng)子CER4P替代載體中的35S啟動(dòng)子，然后抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1b所示。將質(zhì)粒DNA酶切鑒定的菌液送至Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序正確的菌株抽取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。同時(shí)，本研究通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌的GUS染色來(lái)鑒定啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS活性表達(dá)的能力以及進(jìn)一步確認(rèn)農(nóng)桿菌的陽(yáng)性克隆。結(jié)果（圖1c）表明，啟動(dòng)子具有啟動(dòng)GUS活性表達(dá)的能力。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsCER4P：：GUS載體轉(zhuǎn)化水稻，轉(zhuǎn)化植株經(jīng)陽(yáng)性植株鑒定之后，取其愈傷組織、根、莖、葉及小穗進(jìn)行GUS染色，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色方法來(lái)分析OsCER4基因啟動(dòng)子表達(dá)的特異性。GUS染色分析表明，在愈傷組織、根、莖、葉中均能檢測(cè)到GUS活性（圖2）。在穎殼和子房中也有GUS活性表達(dá)，說(shuō)明OsCER4的表達(dá)有組織特異性，可能與營(yíng)養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關(guān)。

2.4 逆境脅迫下OsCER4的表達(dá)分析

為考察水稻蠟質(zhì)合成相關(guān)基因OsCER4對(duì)逆境的響應(yīng)，本研究采用半定量RT-PCR的方法分析不同逆境處理下幼苗中OsCER4表達(dá)變化。結(jié)果（圖3）表明，NaCl處理下對(duì)OsCER4而言，在處理6 h之內(nèi)，其表達(dá)量下降，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)12 h時(shí)，表達(dá)量有所增加；PEG處理下，OsCER4表達(dá)量在處理30 min 后開(kāi)始有所增加，并維持在較高水平，36 h時(shí)略有下降；H2O2處理下，OsCER4表達(dá)量在處理30 min 時(shí)變化不明顯，3 h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始下降。

3 小結(jié)與討論

植物基因啟動(dòng)子控制著基因在特定的組織、特定的發(fā)育階段以及一定的環(huán)境條件下表達(dá)?；蛩憩F(xiàn)的時(shí)空特異性受到該基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)各種順式作用元件與不同反式作用因子之間相互作用的協(xié)調(diào)控制。啟動(dòng)子序列分析表明，OsCER4基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子常有的相應(yīng)調(diào)控元件以及下游組織特異性表達(dá)必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。啟動(dòng)子還含有大量的組織特異表達(dá)順式作用元件：葉肉、莖、根、花器發(fā)育（MYBPLANT）以及微管組織發(fā)育（NTBBF1ARROLB）相關(guān)的特異順式表達(dá)元件，說(shuō)明OsCER4基因可能與營(yíng)養(yǎng)器官和微管組織以及種子的發(fā)育有關(guān)。通過(guò)水稻基因組芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，OsCER4基因在幼苗、幼葉、子房和胚中表達(dá)量較高。而OsCER4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS融合表達(dá)分析表明，OsCER4基因啟動(dòng)子在根、莖、葉、葉枕、穎殼、子房等均有表達(dá)活性，在花藥中幾乎沒(méi)有表達(dá)活性，進(jìn)一步說(shuō)明OsCER4基因可能與營(yíng)養(yǎng)器官和種子的發(fā)育有關(guān)。在對(duì)OsCER4基因（OsGL1-6）的前期研究中發(fā)現(xiàn)，OsCER4基因表達(dá)部位集中于維管束區(qū)域[15]，這一結(jié)果與本研究對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的組織特異表達(dá)順式作用元件分析一致。說(shuō)明OsCER4基因啟動(dòng)子序列上一系列的順式元件決定了其組織器官的表達(dá)。

植物組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子中存在著不同的結(jié)構(gòu)域，通過(guò)這些結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用調(diào)節(jié)著啟動(dòng)子不同的表達(dá)模式。OsCER4基因啟動(dòng)子序列中還有大量干旱、高鹽、病原菌、冷等逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)順式作用元件，說(shuō)明OsCER4基因啟動(dòng)子調(diào)控的下游基因與植物逆境應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。本研究應(yīng)用RT-PCR技術(shù)研究該基因在PEG、高鹽和H2O2等處理下的表達(dá)模式，結(jié)果表明，在高鹽和干旱處理?xiàng)l件下，OsCER4基因表達(dá)量均有所上調(diào)。植物表皮蠟質(zhì)層在植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)外界環(huán)境方面具有重要作用，植物表皮蠟質(zhì)層的增加常常受環(huán)境逆境的誘導(dǎo)。玉米、擬南芥等植物蠟質(zhì)合成中的關(guān)鍵基因在mRNA水平上的表達(dá)受干旱、鹽逆境處理調(diào)節(jié)[20]。擬南芥在150 mmol/L NaCl處理下葉蠟質(zhì)總量增加[5]。水稻幼苗在NaCl、H2O2、ABA等逆境脅迫下，OsGL1-5基因表達(dá)均受到誘導(dǎo)[20]。逆境處理誘導(dǎo)蠟質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)以及增加蠟質(zhì)的積累可能是植物適應(yīng)環(huán)境的一種機(jī)制。蠟質(zhì)合成相關(guān)基因在不同逆境處理下誘導(dǎo)表達(dá)的情況不一樣，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2處理下，OsCER4基因表達(dá)量下降，而在分析OsGL1-5基因的逆境響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)其在H2O2處理下的表達(dá)量增加[21]。高國(guó)賦等[22]的研究也發(fā)現(xiàn)不同蠟質(zhì)合成相關(guān)基因?qū)Σ煌{迫響應(yīng)存在差異，前期研究高溫和低溫對(duì)蠟質(zhì)基因表達(dá)的影響時(shí)也有同樣發(fā)現(xiàn)[16]。

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