孫廣正，吳益磊，張海峰，李金海

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院　普外科，浙江　溫州　325200）

肝細胞肝癌中nectin-4蛋白的表達及其臨床意義

孫廣正，吳益磊，張海峰，李金海

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，浙江溫州325200）

目的：檢測肝細胞肝癌（HCC）組織中nectin-4蛋白表達水平，分析其與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測36例HCC組織及10例正常肝臟組織中的nectin-4蛋白的表達情況，采用x2檢驗分析nectin-4蛋白表達水平與HCC臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果：HCC組織中nectin-4蛋白累積吸光度值為2.55±0.64，陽性區(qū)域面積值為8.96±1.57；正常肝臟組織組中nectin-4蛋白累積吸光度值為1.12±0.58，陽性區(qū)域面積值為5.12±1.43。HCC組織中nectin-4蛋白陽性表達量明顯高于正常肝臟組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。nectin-4蛋白表達量在不同性別、年齡組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與組織病理分化程度（P＜0.01）、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）均明顯相關(guān)。結(jié)論：nectin-4蛋白在HCC組織中呈高表達，其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡性程度密切相關(guān)。

肝臟腫瘤；細胞黏附；nectin-4；免疫組織化學(xué)

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，其不但發(fā)病率高，惡性程度高，預(yù)后差，且起病隱匿，早期診斷困難，術(shù)后易復(fù)發(fā)［1-2］，因此如何從分子水平對HCC進行早期診斷及預(yù)后的判斷是目前研究的重點。nectin-4蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的免疫蛋白超家族中的一員，其不僅參與細胞的黏附、裂解，而且與多種腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系［3］。本研究通過檢測HCC組織及正常肝臟組織中nectin-4蛋白表達情況，并分析相關(guān)臨床病理資料，探討nectin-4蛋白在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　資料和方法

1.1一般資料 收集自2004年8月至2014年8月間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院行手術(shù)治療的HCC患者的肝癌組織石蠟標(biāo)本36例，其中男20例，女l6例，年齡35～77歲，平均56.2歲。收集同期因外傷致肝臟破裂接受手術(shù)的患者（無肝炎及肝硬化等疾?。┑母闻K石蠟標(biāo)本l0例，其中男6例，女4例，年齡19～65歲，平均40.2歲。所有病理切片均經(jīng)兩名高年資病理專家會診確診。HCC患者術(shù)前均未行放、化療。HCC患者中l(wèi)5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，21例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；病理分化程度：高分化（G1）14例，中分化（G2）16例，低分化（G3）6例。

1.2 主要試劑 nectin-4羊抗人單克隆抗體購自美國Bio Basic公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3免疫組織化學(xué)SP法檢測nectin-4蛋白的表達

石蠟切片脫蠟至水化，二甲苯、梯度乙醇（無水、95%、85%、75%）洗5 min，PBS沖洗3次，每次3 min。微波修復(fù)，高、中、低火各5 min，冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min。室溫（18～30 ℃）下用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min。5% BSA孵育20 min；去除PBS，每張切片滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加二抗，室溫孵育20 min。滴加鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液，室溫孵育20 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、溫水返藍。切片梯度乙醇脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封片鏡檢。PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 胞漿著色呈棕黃色提示nectin-4蛋白表達陽性。采用彩色圖像分析系統(tǒng)（Leica Biosystems 5.0，美國徠卡公司）對呈現(xiàn)圖像進行分析：在HIS顏色模式下選中染色陽性區(qū)域，過濾背景干擾，測定累積吸光度（integral opticaldenisity，IOD）值及陽性區(qū)域面積（Area）值。每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性區(qū)域的IOD值和Area值，以每例5個視野的IOD值和Area值的平均值作為該例的測量值［4］。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)處理。所得數(shù)據(jù)用±s表示，采用x2檢驗分析nectin-4蛋白表達水平與HCC臨床病理特征之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1nectin-4蛋白在肝臟組織中的表達情況 在HCC組織中，nectin-4蛋白呈強陽性表達，在正常肝臟組織中少量陽性表達（見圖1）。nectin-4蛋白表達量為：HCC組，IOD值為2.55±0.64，Area值為8.96±1.57；正常肝臟組織組，IOD值為1.12±0.58，Area值為5.12±1.43。HCC組中nectin-4蛋白的陽性表達量顯著高于正常肝臟組織組（P＜0.05）。

2.2nectin-4蛋白的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

在HCC組織中，nectin-4蛋白的表達水平在不同性別、年齡組間的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（IOD：t=2.17，P＜0.05； Area：t=2.06，P＜0.05）、組織病理分化程度（IOD：F=13.52，P＜0.01；Area：F=7.49，P＜0.01）均明顯相關(guān)。見表1。

圖1　nectin-4蛋白在肝臟組織中的表達（SP，×400）

表1　HCC臨床特征與nectin-4蛋白的表達水平的關(guān)系

表1　HCC臨床特征與nectin-4蛋白的表達水平的關(guān)系

臨床病理參數(shù)　n　IOD　P　Area　P年齡（歲）＜55　12　2.51±0.68＞0.05 8.55±1.71＞0.05 ≥55　24　2.55±0.72　8.87±1.62性別男20　2.27±0.66＞0.05 8.44±2.11＞0.05 女16　2.19±0.68　8.32±1.98淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性　15　2.05±0.54＜0.05 9.13±1.44＜0.05陽性　21　2.73±0.68　12.37±1.51病理分級G1　14　1.55±0.37＜0.01 7.43±1.07＜0.01 G2　16　2.81±0.46　9.55±2.12 G3　6　3.53±0.83　12.12±1.47

3　討論

nectin-4蛋白是免疫球蛋白超家族中的一員，屬細胞黏附分子，介導(dǎo)細胞間以及細胞與細胞基質(zhì)間黏附與交聯(lián)，已被證實在多種腫瘤細胞遷移、黏附、增殖過程中發(fā)揮重要作用［5］。人類的nectin-4蛋白多在胎盤組織中表達，以nectin-4蛋白為基礎(chǔ)的細胞黏附的破裂，是E-鈣黏蛋白介導(dǎo)的細胞黏附的裂解以及細胞分離的觸發(fā)器［6］。nectin-4蛋白作為一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原，已被證實在乳腺癌、卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，這提示其將來可能作為一種新的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床［7-8］。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法對HCC組織及正常肝臟組織中的nectin-4蛋白的表達情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)nectin-4蛋白在肝癌細胞的胞漿中集中表達，正常肝臟組織中表達量較少，說明nectin-4蛋白可能參與促進肝臟惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的病理生理過程。這與其在胰腺癌［4］、肺癌［9］中的研究結(jié)果一致。但具體機制目前尚不明確，也是我們下一步研究的重點。

本研究還發(fā)現(xiàn)，nectin-4蛋白的表達量與HCC患者的年齡及性別均無關(guān)（P＞0.05），但其表達量在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者肝臟組織中顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），且分化越差、惡性程度越高的腫瘤組織，其nectin-4蛋白的表達量就越高，說明nectin-4蛋白的強表達可能促進惡性腫瘤細胞的分裂、增殖及侵襲能力，惡化腫瘤的生物學(xué)行為，促進腫瘤的進展。其機制可能與nectin-4蛋白強表達，可明顯促進細胞中間連接體和緊密連接體形成的速度，從而加強惡性腫瘤細胞之間的黏附裂解能力有關(guān)［10-11］。Frenzke等［12］認為，nectin-4蛋白在以E-鈣黏蛋白為基礎(chǔ)的細胞黏附裂解及隨后的細胞分離過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，通過對nectin-4蛋白外功能區(qū)的溶蛋白裂解，可導(dǎo)致80×103的細胞片段或33×103的跨膜和胞內(nèi)片段增殖、分裂。另有研究［13］證實，nectin-4蛋白還可通過促進細胞轉(zhuǎn)化從而促使惡性腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，nectin-4蛋白參與了HCC的發(fā)生、發(fā)展過程，有可能作為HCC的早期診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床。進一步研究nectin-4蛋白參與HCC腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移等的機制可能為HCC的早期診斷、靶向治療及預(yù)后監(jiān)測提供新的方向。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

SUN Guangzheng， WU Yilei， ZHANG Haifeng， LI Jinhai. Department of General Surgery， the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325200

Objective: To study the nectin-4 expressions in hepatocellular carcinoma （HCC） and its clinical significance. Methods: The nectin-4 expression in 36 pairs of HCC tissues， and 10 samples of normal liver tissues were detected with immunohistochemical techniques. The relations of nectin-4 expression with the clinicopathologic parameters were analyzed. Results: The IOD and area of nectin-4 were 2.55±0.64 and 8.96±1.57 in hepatocellular carcinoma tissues， which were significantly higher than those in the normal liver tissues （P＜0.01）. The expression of nectin-4 was not correlated with patients demographics （P＞0.05）， and the protein expression was correlated with histopathologic grade （P＜0.01） and lymph metastasis （P＜0.05）. Conclusion: The high expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma tissues suggests that its high expression may be correlated with the malignant degree of the carcinoma， nectin-4 can be considered as a reference index of differentiation， metastasis and prognosis in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular neoplasms； cell adhesion； nectin-4； immunohistochemistry

R753.2

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.007

2015-02-09

孫廣正（1973-），男，浙江瑞安人，副主任醫(yī)師。