黃盛斌，戴盼盼，毛亦欣，李旭敏，麻健豐

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院　口腔修復(fù)科，浙江　溫州　325027）

RAGE-ROS信號軸在糖尿病性牙周炎牙齦上皮凋亡中的作用

黃盛斌，戴盼盼，毛亦欣，李旭敏，麻健豐

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，浙江溫州325027）

目的：研究RAGE-ROS信號軸在糖尿病性牙周炎牙齦上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生中的作用。方法：選用6周齡雄性Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組（N組）及糖尿病組（D組）。采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。4周后分批處死，檢測牙槽骨喪失、牙齦上皮細(xì)胞凋亡水平，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）及活性氧（ROS）水平。結(jié)果：D組牙槽骨喪失明顯高于N組，且牙齦上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯增加（P＜0.05）；D組牙齦組織RAGE及ROS表達水平也高于N組（P＜0.05）。結(jié)論：RAGE-ROS信號軸在糖尿病性牙周炎牙齦上皮細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮著重要作用，為認(rèn)識糖尿病性牙周炎的發(fā)病機制提供了線索。［關(guān)鍵詞］ 糖尿?。谎乐苎?；細(xì)胞凋亡；活性氧簇；糖基化終末產(chǎn)物受體

糖尿病性牙周炎是一種易造成牙周組織顯著破壞的難治性疾?。?］。牙齦上皮細(xì)胞作為牙周組織的第一道屏障，其凋亡的發(fā)生貫穿糖尿病性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展［2］。糖基化終末產(chǎn)物（advance glycation ends products，AGEs）-糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end products，RAGE）在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，而體外細(xì)胞實驗證實，AGEs與RAGE結(jié)合，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxidative stress，ROS）的生成，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷［3-4］，這提示RAGE-ROS信號軸可能參與糖尿病性牙周炎牙齦上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。因此，本研究構(gòu)建I型糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病對牙槽骨吸收及牙齦上皮細(xì)胞凋亡變化的影響，同時檢測牙齦組織RAGE及氧化應(yīng)激水平，為糖尿病性牙周炎軟組織病理改變闡釋機制。

1　材料和方法

1.1材料 鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司），Nikon體式顯微鏡（SMZ1500），羅氏活力型血糖儀及試紙（瑞士Roche公司），Mitosox Red（美國Invitrogen Life Techonlogy公司），RAGE抗體（英國Abcam公司），DAB試劑盒，TUNEL試劑盒（瑞士Roche公司），磷酸鹽緩沖液（PBS），DMSO（美國Sigma公司），4%多聚甲醛（美國Sigma公司），蘇木素（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2實驗動物分組 清潔級雄性Wistar大鼠30只，6周齡，體質(zhì)量180～220 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。將實驗動物隨機分為2組：糖尿病組（D組，n=15）、正常對照組（N組，n=15），動物分籠飼養(yǎng)，自由攝水?dāng)z食（標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料）。

1.3糖尿病模型建立 實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，D組大鼠按55 mg/kg體質(zhì)量腹腔一次性注射STZ（10 mg/mL）。STZ用枸櫞酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH4.4）配成1%溶液，N組予以枸櫞酸鈉緩沖液空白注射。注射后1周檢測隨機血糖，血糖高于16.65 mmol/L者確定為糖尿病大鼠。注射STZ前及注射后1周、2周、3周及4周檢測各組大鼠隨機血糖。

1.4標(biāo)本采集 4周后采用斷頭法處死大鼠，迅速分離大鼠下頜骨，小心切取完整的下頜舌側(cè)牙齦，放置于PBS溶液中備用；下頜骨浸泡于4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)檢測。

1.5體視顯微鏡觀察下頜后牙牙槽骨的附著喪失面積 采用體視顯微鏡（×20）檢查各組大鼠下頜骨第一磨牙牙槽骨附著喪失（alveolar bone loss，ABL）。每顆牙分別測量近頰、中頰、遠(yuǎn)頰、近腭、中腭、遠(yuǎn)腭6個位點，取6個位點測量值的均值作為此牙的ABL值。

1.6牙齦線粒體活性氧熒光探針檢測 按產(chǎn)品說明，配置Mitosox Red工作液（5 μmol/L），將右側(cè)下頜牙齦組織浸泡于該工作液，室溫下避光平緩搖動孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次。4%多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖置換后，冰凍切片包埋、切片，激光共聚焦顯微鏡（Nikon A1）觀察并拍照。Mitosox red熒光探針可以直接反映組織中的線粒體ROS的生成情況。熒光染色強度越高，則表示氧化應(yīng)激狀態(tài)越高。

1.7免疫組織化學(xué)染色 左下頜舌側(cè)牙齦4%多聚甲醛固定過夜后，30%蔗糖置換，冰凍切片包埋、切片，按免疫組織化學(xué)染色步驟，常規(guī)去除內(nèi)源性過氧化酶、封閉、滴加I抗（RAGE，1∶300）過夜，漂洗，滴加I I抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的，1∶500稀釋），室溫1 h，PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.8牙齦組織細(xì)胞凋亡檢測 左下頜舌側(cè)牙齦組織切片采用TUNEL凋亡試劑盒檢測牙齦組織細(xì)胞凋亡情況（按試劑盒說明書操作）；并復(fù)染DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride），激光共聚焦顯微鏡觀察，隨機選取5個鏡下視野計數(shù)凋亡細(xì)胞，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)用±s表示，用成組t檢驗比較2組各個指標(biāo)的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12組血糖檢測結(jié)果 注射STZ后1周，D組大鼠均達到糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)（血糖＞16.65 mmol/L），且血糖一直持續(xù)＞16.65 mmol/L。見表1。

2.22組牙槽骨吸收情況 與N組比，D組下頜第一磨牙后牙ABL值增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01）。見圖1。

2.22組氧化應(yīng)激水平比較 與N組比較，D組大鼠牙齦組織線粒體ROS紅色熒光明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03）。見圖2。

2.32組RAGE表達比較 RAGE免疫組織化學(xué)染色顯示，D組大鼠牙齦組織RAGE表達增加，牙齦上皮細(xì)胞細(xì)胞膜棕褐色著色明顯，而N組無明顯著色，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.01），見圖3。

2.42組細(xì)胞凋亡水平比較 TUNEL染色顯示，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠牙齦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.03），見圖4。

3　討論

表1　2組大鼠血糖變化情況（n=15，，mmol/L）

表1　2組大鼠血糖變化情況（n=15，，mmol/L）

與N組比：aP＜0.05

組別注射STZ后各時間點0周　1周　2周　3周　4周N組　4.433±0.153　5.167±0.252a　5.200±0.529a　5.133±0.723a　5.367±0.666aD組　4.914±0.434　27.800±2.795a　25.271±2.801a　26.143±1.731a　29.443±2.607a

糖尿病性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展及防治在牙周病研究中倍受關(guān)注［1］。WHO最新公布的數(shù)據(jù)表明，2012年全球糖尿病患者的人數(shù)已超過3.7億，預(yù)計2030年將增至5.52億［3］。這些數(shù)據(jù)揭示了全世界均面臨著糖尿病大幅度增長的巨大威脅，并有擴大化和年輕化的趨勢。因此，構(gòu)建理想的糖尿病動物模型，模擬糖尿病的發(fā)病因素、病理過程和臨床特征，對于研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制及防治方法具有重要的現(xiàn)實意義。

圖1　2組大鼠下頜骨牙槽骨吸收情況

圖2　牙齦組織Mitosox染色（×600）

圖3　牙齦組織RAGE免疫組織化學(xué)染色（×200）

目前國內(nèi)外已有多種構(gòu)建糖尿病動物模型的方法，主要分為自發(fā)性遺傳性動物模型和實驗性動物模型。在本研究中，利用STZ構(gòu)建I型糖尿病模型，建模成功后隨機血糖一直保持在＞16.65 mmol/L水平，明顯高于對照組。整個實驗期間糖尿病大鼠攝食量、飲水量和尿量增多，隨著病程進展，還出現(xiàn)失去光澤、脫毛、消瘦等與人類糖尿病相似的癥狀。這些均表明糖尿病大鼠建模成功，且具有良好的長期穩(wěn)定性。另外，為直接研究糖尿病單一因素引起的牙槽骨吸收，本實驗未使用結(jié)扎線或細(xì)菌涂布制造牙周炎的方法，減少了機械及菌斑誘發(fā)牙周炎發(fā)生的影響因素。

圖4　牙齦組織TUNEL染色（×600）

糖尿病病理狀態(tài)下，AGEs加速形成并積聚于各個組織中，同時促進其受體RAGE的激活和上調(diào)［4-5］。本研究對牙齦組織進行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病牙齦組織RAGE表達增加。Katz等［6］通過對伴有或不伴有糖尿病的牙周炎患者的牙齦組織進行RTPCR檢測，發(fā)現(xiàn)前者比后者牙齦組織中RAGE mRNA的表達增加了50%，認(rèn)為AGEs與RAGE的相互作用對牙周組織產(chǎn)生損傷，這一結(jié)果與本實驗研究結(jié)果一致，進一步證實了RAGE參與了糖尿病性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展。

體外細(xì)胞實驗證實，RAGA與AGEs相互作用能促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活［7］，導(dǎo)致細(xì)胞氧化-抗氧化防御系統(tǒng)失衡，造成ROS生成增多，促進炎性遞質(zhì)釋放，參與牙周炎發(fā)生、發(fā)展。而臨床實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病患者牙周組織的氧化應(yīng)激水平比非糖尿病患者明顯增加［8-9］，這與本研究Mitosox的染色結(jié)果一致。Mitosox為線粒體ROS的標(biāo)志物染色，這提示糖尿病可能直接影響牙周組織線粒體功能。而最新研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎的牙周組織線粒體ATP水平下降，線粒體酶活性降低［10］，因此，可以推斷線粒體功能障礙及氧化應(yīng)激在糖尿病性牙周炎的發(fā)病中可能起著關(guān)鍵作用。

Graves等［11］對糖尿病加重牙周組織破壞的內(nèi)在機制進行了大量研究，認(rèn)為糖尿病引起TNF-α等炎癥遞質(zhì)表達增加可通過加強基質(zhì)生成細(xì)胞的凋亡影響組織愈合。付永偉等［12-13］建立糖尿病牙周炎動物模型，發(fā)現(xiàn)糖尿病可促進炎癥過程中骨細(xì)胞的凋亡，增加牙周炎骨喪失，同時可加強牙周炎條件下牙周膜中成纖維細(xì)胞的凋亡來促進牙周組織破壞。鄧天政等［14］構(gòu)建糖尿病牙周炎動物模型，發(fā)現(xiàn)牙周組織成骨細(xì)胞及牙周膜成纖維細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于對照組，并發(fā)現(xiàn)RAGE在牙周膜成纖維細(xì)胞中表達增加，提示RAGE可引起牙周細(xì)胞的凋亡從而參與組織損傷。在本研究中，D組大鼠牙齦組織凋亡細(xì)胞顯著高于N組，且RAGE及氧化應(yīng)激水平明顯增加，這進一步提示RAGE-ROS參與了糖尿病性牙周炎中牙齦上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡，但其具體的機制還需進一步明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠牙齦組織中RAGE表達上調(diào)，氧化應(yīng)激水平增加，這一病理改變參與并促進糖尿病性牙周炎牙齦上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終誘發(fā)牙槽骨的吸收。因而，RAGE-ROS信號軸可能成為調(diào)控糖尿病性牙周炎發(fā)生、發(fā)展的新靶點。

［1］Taylor JJ， Preshaw PM， Lalla E. A review of the evidence for pathogenic mechanisms that may link periodontitis and diabetes［J］. Clin J Periodontol， 2013， 40 suppl 14: S113-134.

［2］Desta T， Li J， Chino T， et al. Altered fibroblast proliferation and apoptosis in diabetic gingival wounds［J］. J Dent Res，2010， 89（6）: 609-614.

［3］International Diabetes Federation. （2012） IDF Diabetes Atlas［R］. 5th ed. International Diabetes Federation， 2012.

［4］Cipollone F， Iezzi A， Fazia M， et al. The receptor RAGE as a progression factor amplifying arachidonate-dependent inflammatory and proteolytic response in human atherosclerotic plaques: role of glycemic control［J］. Circulation， 2003，108（9）: 1070-1077.

［5］Ramasamy R， Vannucci SJ， Yan SS， et al. Advanced glycation end products and RAGE: a common thread in aging， diabetes， neurodegeneration， and inflammation［J］. Glycobiology， 2005， 15（7）: 16-28.

［6］Katz J， Bhattacharyya I， Farkhondeh-Kish F， et al. Expression of the receptor of advanced glycation end products in gingival tissue of type 2 diabetes patients with chronic periodontal disease: a study utilizing immunohistochemistry and RT-PCR［J］. J Clin Periodontol， 2005， 32（1）: 40-44.

［7］Thomas MC， Forbes JM， Cooper ME. Advanced glycation end products and diabetic nephropathy［J］. Am J Ther，2005， 12（6）: 562-572.

［8］Schmidt AM， Weidman E， Lalla E， et al. Advanced glycation end products （AGEs） induce oxidant stress in the gingiva: a potential mechanism underlying accelerated periodontal disease associated with diabetes［J］. J Periodontal Res， 1996， 31 （7）: 508-515.

［9］Takeda M， Ojima M， Yoshioka H， et al. Relationship of serum advanced glycation end products with deterioration of periodontitis in type 2 diabetes patients［J］. J Periodontol， 2006，77（1）: 15-20.

［10］ Govindaraj P， Khan NA， Gopalakrishna P， et al. Mitochondrial dysfunction and genetic heterogeneity in chronic periodontitis ［J］. Mitochondrion， 2011， 11（3）: 504-512.

［11］ Graves DT， Liu R， Alikhani M， et al. Diabetes enhanced inflammation and apotosis-impact on periodontal pathology［J］. J Dent Res， 2006， 85（1）: 15-21.

［12］ 付永偉， 和紅兵， 歐炯光. 實驗性糖尿病牙周炎誘導(dǎo)骨細(xì)胞凋亡的初步研究［J］. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 23（5）：500-504.

［13］ 付永偉， 和紅兵， 歐炯光. 實驗性糖尿病牙周炎牙周膜中成纖維細(xì)胞凋亡的初步研究［J］. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2010，26（3）： 310-314.

［14］ 鄧天政， 呂晶， 逢鍵梁， 等. 細(xì)胞凋亡在糖尿病大鼠牙周炎中參與牙槽骨吸收的實驗研究［J］. 北京口腔醫(yī)學(xué)， 2010，18（5）： 257-260.

（本文編輯：吳彬）

The role of RAGE-ROS axis in the apoptosis of gingival fibroblast in diabetic periodontitis

HUANG Shengbin， DAI Panpan， MAO Yixin， LI Xumin， MA Jianfeng. Department of Prosthodontics， Hospital of Stomatology Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027

Objective: To investigate the role of RAGE-ROS axis in the apoptosis of gingival fibroblast in diabetic periodontitis. Methods: Thirty wistar rats （male， six weeks old） were randomly divided into two groups: normal control group （N） and diabetic periodontitis group （D）. Four weeks later， animals were sacrificed； meanwhile， the alveolar bone loss and apoptosis of gingival fibroblast were detected while the expression of RAGE and oxidative stress marker were also investigated. Results: Compared to N group， more severe alveolar bone loss， along with more apoptosis of gingival fibroblast appeared in D group （P＜0.05）. The expression of RAGE and oxidative stress marker increased significantly in gingival tissue in D group （P＜0.05）. Conclusion: RAGEROS axis plays an important role in the apoptosis of gingival fibroblast in diabetic periodontitis.

diabetes； periodontitis； apoptosis； reactive oxidative stress； receptor of advanced glycation end products

R781.4

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.002

2015-11-16

國家自然科學(xué)基金資助項目（81500817）；浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY15H140008）；溫州市公益技術(shù)研究醫(yī)學(xué)項目（Y20140708）。

黃盛斌（1982-），男，浙江慶元人，講師，博士。

麻健豐，教授，Email：dentistmacn@aliyun.com。