李紅等

摘要：采用同工酶電泳技術(shù)和傳統(tǒng)的拮抗試驗(yàn)對遼寧省10個(gè)黑木耳（Auricularia auricular-judae）主栽品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，在相異水平70%左右時(shí)，這10個(gè)黑木耳品種可以分為3類。表明遼寧省黑木耳主栽品種間具有不同的親緣關(guān)系，但是部分品種間親緣關(guān)系較近，多態(tài)性不強(qiáng)。酯酶同工酶聚類分析結(jié)果與拮抗試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：黑木耳（Auricularia auricular-judae）；酯酶同工酶；拮抗試驗(yàn)；遺傳多樣性分析

中圖分類號：S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）17-4211-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.026

同工酶是一種催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的酶的分子類型。雖然不是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，但是由于表達(dá)的是蛋白質(zhì)水平上的信息，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)真菌分類的不足，在一定程度上可以作為菌株遺傳背景鑒定的依據(jù)，且與形態(tài)學(xué)分類和現(xiàn)代分子標(biāo)記分類法相比，具有直觀、快速等優(yōu)點(diǎn)，也是一種常用的化學(xué)標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物等許多學(xué)科[1]。目前已有近百種同工酶被應(yīng)用于真菌的分類鑒定和遺傳育種，也廣泛應(yīng)用于黑木耳（Auricularia auricular-judae）交配型的測定、親緣關(guān)系分析、菌種鑒定等方面[2]。

黑木耳是中國最早開始人工栽培的食用菌，具有非常重要的食藥用價(jià)值，是中國傳統(tǒng)出口產(chǎn)品，銷往日本、泰國、新加坡、澳大利亞以及西歐、北美、東歐等國家[3]。遼寧省是僅次于黑龍江省和吉林省的黑木耳生產(chǎn)大省，所使用的菌株部分來自野生菌株人工馴化，部分引自黑龍江省、吉林省和其他區(qū)域。為了加強(qiáng)遼寧省黑木耳菌種的質(zhì)量管理體系，需要對遼寧省黑木耳栽培種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行評價(jià)，以便更好地開展黑木耳的良種選育，保護(hù)黑木耳新品種知識產(chǎn)權(quán)，促進(jìn)黑木耳產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑木耳品種 試驗(yàn)所用黑木耳品種見表1，均為遼寧省的主栽品種。

1.1.2 培養(yǎng)基 加富PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊脂2%，維生素B1適量，自來水定容至1 000 mL，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 挑取1 cm2供試黑木耳菌絲在馬鈴薯固體培養(yǎng)基上活化，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d，定期檢查有無污染現(xiàn)象，將污染的菌株及時(shí)清除，將活化好的、菌絲長勢強(qiáng)的菌種用于拮抗試驗(yàn)。

1.2.2 拮抗試驗(yàn) 每個(gè)菌種用直徑0.6 cm的打孔器打取3個(gè)菌絲塊，交叉循環(huán)，3次重復(fù)，在直徑9 cm平板上按“品”字形接種活化的菌種。菌株間距3 cm左右，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察拮抗線形成情況。

1.2.3 酯酶同工酶鑒定 將活化后的供試菌株轉(zhuǎn)接到加富培養(yǎng)基斜面上，25 ℃避光培養(yǎng)8～14 d，收集長滿培養(yǎng)基表面的菌絲0.5 g，加入等量液氮研磨，于4 ℃、10 000 r/min離心20 min。棄去沉淀取上清，置于2 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

采用垂直平板不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。將樣品與40%蔗糖1∶1（V/V）混合后點(diǎn)樣，加樣量30～50 μL，先低壓電泳一段時(shí)間，待進(jìn)入分離膠后再加大到所需電壓，電泳在0～4 ℃冰箱中進(jìn)行。電泳完畢后，將膠板從電泳槽上卸下來，置于白磁盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)即可染色和固定，并于4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株間的拮抗反應(yīng)

拮抗反應(yīng)實(shí)質(zhì)為體細(xì)胞不親和性（或稱為營養(yǎng)不親和性或異核體不親和性），因其所表現(xiàn)的外部性狀與拮抗相似而被稱作拮抗，是一種在同種的遺傳型不同的組織接觸時(shí)防止融合和重組的機(jī)制，拮抗線試驗(yàn)又廣泛用于絲狀真菌種內(nèi)菌株的鑒定、分類或是否同種異名。不同菌株間的拮抗反應(yīng)結(jié)果見表2。從表2可以看出，M2和M10組合、M4和M32組合、M10和M14組合、M11和M26組合、M13和M23組合均無拮抗反應(yīng)，親緣關(guān)系非常近或?yàn)橥锂惷?；M2和M13、M23、M28組合，M4和M23、M26組合，M13和M14、M26、M28、M32組合，M23和M32組合，M26和M28、M32組合，M28和M32組合有明顯拮抗反應(yīng)，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為獨(dú)立菌株；其他組合有拮抗反應(yīng)，但是不明顯，親緣關(guān)系較近。

2.2 遼寧省黑木耳主栽品種酯酶同工酶的多態(tài)性分析

由圖1可見，在相同條件下，10個(gè)菌株共出現(xiàn)了13條酶帶，遷移率為0.073～0.663（El 0.073，E2 0.135，E3 0.337，E4 0.371，E5 0.388，E6 0427，E7 0.455，E8 0.494，E9 0.534，E10 0.573，E11 0.601，E12 0.618，E13 0.663），其中E7、E8、E9是10個(gè)菌株共同擁有的3條基礎(chǔ)特征酶帶，且酶帶顏色深，活性強(qiáng)。不同菌株酶帶在分布、寬窄、顏色及數(shù)量等方面有一定的差異性，M23、M13這2個(gè)菌株在Rf=0.57處有一條特異性酶帶，顏色較淺，可作為菌株相互區(qū)別的鑒定依據(jù)。M4、M11、M14、M26這4個(gè)菌株在酶帶的位置和數(shù)量上差異不大，說明這4個(gè)菌株親緣關(guān)系較近，只是酶帶的顏色有些不同，酶的活力有些差異。而酶帶E1、E2、E5、E13均為單個(gè)菌株特有的酶帶。

2.3 聚類分析

利用DPS數(shù)值處理系統(tǒng)軟件中的UPGMA計(jì)算10個(gè)黑木耳菌株酶譜之間的聯(lián)合系數(shù)，并對所得的酶帶進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類分析樹狀圖見圖2。結(jié)果顯示，在相異水平70%左右時(shí)，可以把這10個(gè)菌株分為3類：第一類包括M2、M4、M11、M26、M28、M32這6個(gè)菌株；第二類包括M10菌株和M14菌株；第三類包括M13菌株和M23菌株。M4菌株和M32菌株幾乎沒有差異，為同物異名。聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征基本趨同。

3 小結(jié)

本研究運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)和傳統(tǒng)的拮抗試驗(yàn)對遼寧省10個(gè)黑木耳主栽品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示兩種方法所得到的結(jié)果基本一致：遼寧省黑木耳主栽品種間具有不同親緣關(guān)系，但是部分品種間親緣關(guān)系較近，遺傳背景比較一致，可能是由于同一地域的主栽菌株一般由當(dāng)?shù)匾吧犟Z化所得，多態(tài)性不強(qiáng)。康達(dá)1號和黑威15分別是兩個(gè)食用菌企業(yè)的當(dāng)家品種，親緣關(guān)系非常近，有可能是從黑龍江省或吉林省引進(jìn)的品種，種源不清，可能為同物異名。黑木耳遺傳多樣性研究是黑木耳育種的重要環(huán)節(jié)，通過對品種間親緣關(guān)系的研究可以有效地對親本選配和特殊種質(zhì)的保護(hù)提供指導(dǎo)。

用同工酶標(biāo)記能在一定程度上反映不同樣品的遺傳差異，但同工酶多態(tài)性不豐富，可檢測的位點(diǎn)少，試驗(yàn)結(jié)果會(huì)因菌株培養(yǎng)材料、培養(yǎng)時(shí)間等因素的變化而變化。在今后的研究中，將引入ISSR[4]、RAPD等不同分子標(biāo)記分析遺傳多樣性，以便為黑木耳的鑒定分類作出更加科學(xué)合理的解釋提供依據(jù)[5]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 黎，范秀芝，肖 揚(yáng)，等.中國木耳栽培種質(zhì)生物學(xué)特性及遺傳多樣性分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2010，29（5）：644-652.

[2] 楊立紅，黃清榮，辛?xí)粤?，?食用菌菌種選育中酯酶同工酶的應(yīng)用研究[J].食用菌，2005，27（6）：12-14.

[3] 黃年來，林志彬，陳國良，等.中國食藥用菌學(xué)（下篇）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010.

[4] 宋小亞，肖 揚(yáng)，邊銀丙.ISSR標(biāo)記在黑木耳單核體遺傳分析中的應(yīng)用[J].菌物學(xué)報(bào)，2007，26（4）：528-533.

[5] 董昌金，江 涓.RAPD和酯酶同工酶技術(shù)在香菇雜交育種中的應(yīng)用[J].食用菌學(xué)報(bào)，2000，7（1）：1-7.