尤丹瑜，羅叢偉，萬建新

慢性腎臟疾病中，趨化因子如單核趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在 腎 組織中的表達(dá)增加常常伴隨著腎臟纖維化的進(jìn)展［1］，尿液中的MCP－1可以早期預(yù)測腎臟疾?。?］。補(bǔ)體C3片段C3a受體（compleneut 3areceptor，C3aR）是一個55kDa大小的蛋白質(zhì)，主要分布于人腎小管上皮細(xì)胞、腎小囊臟層和壁層上皮細(xì)胞［3］。C3a－C3aR可以介導(dǎo)腎小管上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化［4］；并可能通過激活TGF－β／Smad3信號通路促進(jìn)糖尿病腎病模型腎臟纖維化［5］。尿酸（uric acid，UA）已經(jīng)被證明可以有效地誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP－1［6］。筆者擬將 UA作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞（human renal proximal tubular epithelial cell line，HK－2）表達(dá)MCP－1，并觀察C3在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HK－2（中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫，細(xì)胞編號3142C0001000000136）；DMEM／F12培養(yǎng)基（批號：NAB1336，美國 Hyclone公司）；Trizol（批號：S0175111，美國Invitrogen 公司）；cDNA第一鏈合成試劑盒及RT－Q－PCR試劑盒（批號：00246705，BK1001，日本 TaKaRa公司）；ELISA試劑盒（批號：EK0441，武漢博士德公司）；UA（批號：156158，美國 Sigma－Aldrich公司）；C3a（批號：H1608，美 國 Santa Cruz 公 司）；X－tremeGENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒（批號：04476115001，瑞士Roche公司）；C3aR阻斷劑SB290157（批號：H1457，美國Santa Cruz公司）；雙鏈小干擾 RNA（批號：SL01100，美國Sigma－Aldrich公司）。

1.2 方法

1.2.1 HK－2 培養(yǎng)、傳代 HK－2 細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為DMEM／F12培養(yǎng)基添加10%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。每隔48h更換培養(yǎng)基1次，待細(xì)胞生長至80%～90%融合，即可傳代。傳代時，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶0.8mL后于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)視野中絕大多數(shù)細(xì)胞開始皺縮、彼此分離時，棄去胰酶，加入適量培養(yǎng)基并用移液管輕柔吹打瓶底，使細(xì)胞脫落形成懸液，按1∶3分裝接種，移入新的培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基。

1.2.2 UA誘導(dǎo) 將生長至80%～90%的細(xì)胞按照以上步驟消化并用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸后，吹打混勻，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為0.5×105mL－1。將細(xì)胞懸液沿每孔孔壁同側(cè)勻速加入6孔板中，每孔加液量為2.5mL。正常換液，待細(xì)胞生長至70%融合時，棄去原培養(yǎng)基并用PBS清洗2遍，加入無血清DMEM／F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化。棄去原培養(yǎng)基，分別于各孔中加入0，75，150，300，600μmol／L的 UA－DMEM／F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）的結(jié)果選取最適濃度。在細(xì)胞同步化后0h（48h組）、24h（24h 組）、36h（12h 組）、42h（6h 組）時加 入UA－DMEM／F12培養(yǎng)基，并同時更新其他各組及空白對照組（0h組）的DMEM／F12培養(yǎng)基（或UADMEM／F12培養(yǎng)基），于同步化后48h結(jié)束干預(yù)，通過RT－PCR法選取最合適的干預(yù)時間。

1.2.3 C3小干擾RNA轉(zhuǎn)染 按前述細(xì)胞種板步驟進(jìn)行細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)及種板，正常換液待細(xì)胞生長至50%融合時，棄去原培養(yǎng)基并用PBS清洗2遍后在各孔中加入1mL無血清DMEM／F12培養(yǎng)基。將3μg siRNA用300μL無血清培養(yǎng)基稀釋混勻，另取轉(zhuǎn)染試劑15μL用無血清培養(yǎng)基300μL稀釋并吹打混勻后緩慢加入到已稀釋好的siRNA液體中，輕柔吹打混勻后于15～25℃下靜置15～20min。在6孔板中每孔加入無血清DMEM／F12 900μL，后將轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的混合液加入到6孔板中，每孔加100μL，加液完畢混勻。于轉(zhuǎn)染后5h棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗1遍后加入含10%FBS的DMEM／F12，繼續(xù)培養(yǎng)24h后更換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化，24h后進(jìn)行UA干預(yù)。小干擾RNA序列如下：

1.2.4 RT－PCR 干預(yù)結(jié)束后用 Trizol液提取細(xì)胞總RNA，用DEPC處理過的純水溶解RNA。采用紫外分光光度儀測定RNA含量。按照TaKaRa公司 PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，序列如下：

PCR 反應(yīng)條件如下：β－actin：94 ℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸30s，共28個循環(huán)。MCP－1：94℃變性30s→61℃退火30s→72℃延伸30s，共30個循環(huán)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5mL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳40min，于紫外燈下拍照，采用Tanon圖像識別軟件進(jìn)行分析，以內(nèi)參β－actin光密度值校正，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，比值表示其相對含量。

1.2.5 實(shí)時熒光定量 PCR（real－time quantitative PCR，Q－PCR） 按照 TaKaRa 公 司 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件：采用ABI PRISM7500Fast型熒光 PCR 儀及 SYBR Green PCR二步法進(jìn)行PCR反應(yīng)。預(yù)變性：95℃預(yù)變性30s；二步法擴(kuò)增：95℃變性5s，60℃34s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后熒光定量分析軟件自動繪制擴(kuò)增動力曲線和溶解曲線，結(jié)果用CT值表示，即在指數(shù)增長初期，熒光信號跨越閾值時的循環(huán)數(shù)。采用比較CT值相對定量方法算出各待測樣品的相對初始拷貝數(shù)即RQ值。各目的基因和內(nèi)參照基因序列如下：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5軟件分析，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中各組與對照組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；其余各組間比較采用單因素方差分析（除有特殊說明以外），之后的兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)［不滿足方差齊性者（P＜0.1）采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)］，P＜0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度UA在不同時間對 MCP－1mRNA表達(dá)的影響

2.1.1 不同濃度 UA對 MCP－1mRNA表達(dá)的影響 RT－PCR結(jié)果顯示：培養(yǎng)于DMEM／F12培養(yǎng)基中的 HK－2細(xì)胞可表達(dá) MCP－1mRNA，經(jīng)75，150，300，600μmol／L UA誘導(dǎo)24h后可見：不同濃度UA對 MCP－1mRNA表達(dá)的影響并不相同，其中150μmol／L UA 可使 MCP－1mRNA 表達(dá)明顯增加（圖1）。

圖1 不同濃度UA對MCP－1mRNA表達(dá)的影響Fig1 The expression of MCP－1mRNA induced by UA of different concentrations

2.1.2 150μmol／L UA 在不同時間對 MCP－1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 RT－PCR結(jié)果顯示：培養(yǎng)于DMEM／F12培養(yǎng)基中的 HK－2細(xì)胞表達(dá) MCP－1 mRNA，經(jīng)6，12，24，48hUA 誘導(dǎo)后，可見 MCP－1 mRNA在6h和12h時表達(dá)最明顯，此后隨著時間延長，UA表達(dá)逐漸減少（圖2）。選取12h作為后續(xù)試驗(yàn)的UA誘導(dǎo)時間。

圖2 150μmol／L UA 在不同時間對 MCP－1 mRNA表達(dá)的影響Fig2 The expression of MCP－1mRNA induced by 150μmol／L UA in different periods

2.2 C3siRNA干預(yù)對C3及 MCP－1mRNA表達(dá)的影響 Q－PCR法檢測C3siRNA轉(zhuǎn)染對于150μmol／L UA誘導(dǎo)12h的各組 HK－2細(xì)胞C3、MCP－1表達(dá)水平的影響。該結(jié)果示：與單純UA干預(yù)組比較，Control siRNA 轉(zhuǎn)染組的 C3、MCP－1 mRNA表達(dá)無明顯改變；而C3siRNA轉(zhuǎn)染組的C3、MCP－1mRNA 表達(dá)水平較 Control siRNA 轉(zhuǎn)染組明顯下降（圖3）。

圖3 C3siRNA干預(yù)對C3和 MCP－1mRNA表達(dá)的影響Fig3 The expression of C3and MCP－1 mRNA influenced by C3siRNA

2.3 C3aR阻斷劑SB290157對C3、MCP－1、C3aR mRNA表達(dá)的影響 經(jīng)Q－PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，150μmol／L UA干預(yù)12h可顯著上調(diào) HK－2細(xì)胞C3、MCP－1、C3aR mRNA的表達(dá)，終濃度為1μmol／L的C3aR阻斷劑SB290157預(yù)處理顯著抑制了UA誘導(dǎo)的 MCP－1mRNA表達(dá)（圖4）。

圖4 C3aR 阻斷劑對 C3、MCP－1和 C3aR mRNA表達(dá)的影響Fig4 The expression of C3，MCP－1and C3aR mRNA influenced by SB290157

2.4 C3a聯(lián)合UA干預(yù)對 MCP－1mRNA表達(dá)的影響 為進(jìn)一步證明C3aR激活與HK－2細(xì)胞MCP－1表達(dá)的關(guān)系，采用100nmol／L C3a預(yù)處理不同干預(yù)條件下的細(xì)胞，并使用Q－PCR檢測干預(yù)后的 MCP－1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示：C3a單獨(dú)干預(yù)8h僅微弱上調(diào)HK－2細(xì)胞 MCP－1mRNA的轉(zhuǎn)錄，但當(dāng)其與150μmol／L UA共同干預(yù)相同時間則顯著上調(diào)了UA誘導(dǎo)的 MCP－1mRNA轉(zhuǎn)錄（圖5）。

圖5 C3a聯(lián)合UA干預(yù)對MCP－1mRNA表達(dá)的影響Fig5 The expression of MCP－1mRNA influenced by C3aand UA

3 討 論

UA與慢性腎臟病關(guān)系密切，流行病學(xué)研究證明，血清UA水平是預(yù)測腎臟疾病進(jìn)展的一個重要因素［7－8］。升高的血UA水平與系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)有關(guān)，UA刺激大鼠的血管平滑肌細(xì)胞，可激活絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK及ERK1／2）和環(huán)氧合酶－2（cyclol－oxygenase－2，COX－2），使得 C反應(yīng)蛋白（C－reaction protein，CRP）及 MCP－1的表達(dá)顯著增加［9］。而MCP－1為趨化因子家族成員，正常人近曲小管上皮細(xì)胞HK－2可表達(dá)少量 MCP－1，并且可在某些細(xì)胞因子、CD40L、蛋白等誘導(dǎo)下高表達(dá)MCP－1［10］。在人的腎臟活組織標(biāo)本中，MCP－1的表達(dá)水平與腎臟中巨噬細(xì)胞的浸潤水平明顯相關(guān)，尿液中MCP－1的水平則與腎臟疾病的活動度相關(guān)聯(lián)［11－12］。該研究也提示了 UA 對 MCP－1mRNA 有上調(diào)作用。

而UA如何上調(diào)MCP－1mRNA表達(dá)，筆者認(rèn)為其機(jī)制可能與UA激活C3或C3aR有關(guān)。本研究中，C3siRNA轉(zhuǎn)染或C3aR阻斷能夠抑制被UA上調(diào)的 MCP－1mRNA表達(dá)；C3a顯著增強(qiáng)了UA對MCP－1mRNA的誘導(dǎo)作用。首先，HK－2細(xì)胞可以在一定濃度的UA誘導(dǎo)下呈時間依賴性地過表達(dá)MCP－1mRNA，并且這種誘導(dǎo)可被C3aR阻斷劑SB290157顯著抑制。C3aR阻斷劑SB290157為一種選擇性、高親和力并競爭性結(jié)合C3aR的非肽類小分子三氟乙酸鹽，已在C3a－C3aR的相關(guān)研究中被運(yùn)用于 HK－2細(xì)胞系，1μmol／L SB290157可成功阻斷C3a誘導(dǎo)的HK－2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化［5］。另外，單獨(dú)使用C3a進(jìn)行干預(yù)時，MCP－1mRNA表達(dá)雖有上升，但當(dāng)C3a與UA共同作用于HK－2細(xì)胞時，MCP－1mRNA表達(dá)明顯增加。由此，筆者推測C3a－C3aR的相互作用為 UA介導(dǎo)的 HK－2細(xì)胞MCP－1mRNA的表達(dá)起到類似于信號放大的作用。在UA介導(dǎo)的 MCP－1mRNA表達(dá)過程中，可能涉及另一條未知信號通路的激活，并且該通路的激活是C3a促進(jìn)HK－2細(xì)胞MCP－1mRNA表達(dá)的必要條件。為進(jìn)一步探究C3aR激活在 MCP－1 mRNA表達(dá)中所扮演的角色，筆者需要對可能涉及到的細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制進(jìn)一步研究。目前關(guān)于C3aR激活在MCP－1生成中可能涉及到的細(xì)胞內(nèi)信號機(jī)制包括如下幾個方面：（1）C3aR羧基端集簇Ⅱ內(nèi)PDZ結(jié)構(gòu)域的磷酸化與細(xì)胞內(nèi)核因子－κB信號通路的激活［13］；（2）補(bǔ)體系統(tǒng)的激活與不同絲裂原活化蛋白激酶信號通路的活化［14］；（3）腎素－血管緊張素系統(tǒng)激活在C3a介導(dǎo)的 MCP－1產(chǎn)生中的作用［15－17］。這也為筆者今后進(jìn)一步的研究提供方向。

由于MCP－1等因子所介導(dǎo)的炎性細(xì)胞向小管間質(zhì)區(qū)的浸潤是腎臟纖維化進(jìn)展的重要促進(jìn)因素，抑制C3的激活或阻斷C3a－C3aR相互作用可能成為防止腎纖維化進(jìn)展的又一重要手段。

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