李春紅，蔣明廉

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生，廣西 南寧　530001；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，廣西 南寧　530022）

理論探討

HPLC法測(cè)定黃金甲跌打生肌膏中龍血素B的含量

李春紅1，蔣明廉2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)2012級(jí)碩士研究生，廣西 南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，廣西 南寧530022）

［目的］建立黃金甲跌打生肌膏中龍血素B的含量測(cè)定方法。［方法］采用HPLC法，色譜柱：Thermo C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-冰醋酸（1→900）（40∶60），流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：20 μl。［結(jié)果］龍血素B在濃度42.88～857.6 μg間呈良好線性關(guān)系（r=0.999），平均加樣回收率為100.32%，RSD為1.55%（n=6）。［結(jié)論］該方法重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為黃金甲跌打生肌膏的質(zhì)量控制手段。

黃金甲跌打生肌膏；龍血素B；HPLC

黃金甲跌打生肌膏也稱裕隆藥膏，為廣西興安縣謝裕隆醫(yī)師治療跌打損傷、軟組織損傷、燒燙傷、風(fēng)濕腫痛及各種開(kāi)放性傷口的臨床驗(yàn)方。該方是由龍血竭、當(dāng)歸、川芎、麻油等藥經(jīng)過(guò)油炸加工及高壓消毒精制而成的黑色糊狀膏，具有清熱解毒、涼血活血、消腫止痛、祛腐生肌等功效。本文應(yīng)用HPLC法測(cè)定黃金甲跌打生肌膏中龍血素B的含量，方法可靠，可作為黃金甲跌打生肌膏的質(zhì)量控制方法。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜（美國(guó)賽默飛，型號(hào)：U3000）；電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：HHS-21-6）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，型號(hào)：SHB-ⅢA）；電子天平（瑞士梅特勒，型號(hào)：AJ150）。

1.2試藥黃金甲跌打生肌膏由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥民族藥研發(fā)基地提供（批號(hào)：20140325，20140425，20140525）；龍血素B對(duì)照品（供含量測(cè)定用，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111558-200303）；乙腈為色譜純；甲醇、冰醋酸為分析純；超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Thermo C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Lot No：018-01-157）；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；流動(dòng)相：乙腈-冰醋酸（1→900）（40∶60）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μl；理論塔板數(shù)以龍血素B計(jì)不低于10 000。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取龍血素B對(duì)照品適量（0.01072 g），置10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，移液管移取1 ml置100 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得濃度為10.72 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取黃金甲跌打生肌膏3.00 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，于100℃水浴上回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液適量，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4陰性樣品溶液的制備按處方及工藝制備不含龍血竭的黃金甲跌打生肌膏，并按照“2.3”項(xiàng)方法制備陰性樣品溶液。

精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果龍血素B出峰時(shí)間在28.5 min左右，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　HPLC色譜圖

2.5線性關(guān)系考察取對(duì)照品溶液母液（濃度為1.072 mg/ml），以移液管移取1 ml置25 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得濃度為42.88 μg/ml的對(duì)照品溶液。分別精密吸取稀釋后的龍血素B對(duì)照品溶液（濃度為42.88 μg/ml）0.5，1，2，4，8，10 ml 置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成龍血素B對(duì)照品系列濃度溶液。分別取上述6個(gè)濃度的溶液各20 μl注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，以峰面積（mAU）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程為Y=0.748X+0.384，r=0.999。結(jié)果表明龍血素B在濃度42.88～857.6 μg間呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　龍血素B標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6精密度試驗(yàn)取黃金甲跌打生肌膏（批號(hào)：20140425），按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定龍血素B峰面積值，RSD=0.42%（n=6），表明精密度較高，儀器測(cè)定可靠。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果　（n=6）

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取黃金甲跌打生肌膏（批號(hào)：20140425），按照“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，于制備后0，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣20 μl，測(cè)定龍血素B峰面積值，結(jié)果RSD為0.79% （n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，測(cè)定方法可靠。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果?。╪=6）

2.8重復(fù)性試驗(yàn)稱取黃金甲跌打生肌膏（批號(hào)：20140425）3.00 g，共6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果龍血素B的平均含量為0.2799 mg/g，RSD為0.95%（n=6），表明本方法重復(fù)性好，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果?。╪=6）

2.9加樣回收率試驗(yàn)稱取已知龍血素B含量（0.2782 mg/g）的黃金甲跌打生肌膏（批號(hào)：20140425）1.50 g，精密稱定6份，分別精密加入龍血素B對(duì)照品溶液（1.072 mg/ml）145 μl，按“2.3”項(xiàng)方法制備待測(cè)溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，平均加樣回收率100.32%，RSD為1.55%（n=6），表明回收率高，方法可靠。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果　（n=6）

2.10樣品測(cè)定分別稱取不同批次的黃金甲跌打生肌膏

3.00g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定龍血素B含量，計(jì)算方法為：CX=CRAX/AR（AX為供試品的峰面積，AR為對(duì)照品的峰面積，CX為供試品溶液的濃度，CR為對(duì)照品溶液的濃度）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　黃金甲跌打生肌膏中龍血素B的含量測(cè)定（n=3）

3　討論

3.1龍血竭具有活血散瘀、消炎止痛、收斂止血、生肌斂瘡、補(bǔ)血益氣等功效，用于跌打損傷、瘀血作痛、外傷出血［1］。其主要含龍血素A、龍血素B、7，4'-二羥基黃酮、白藜蘆醇以及甾醇類和皂苷類化合物等成分［2-3］。其中以龍血素B（4-羥基-2，4，6-三甲氧基二氫查耳酮）為代表的二氫查耳酮類成分是其活血化瘀的主要有效成分［4-5］。本文參考文獻(xiàn)［6-7］，采用HPLC法測(cè)定血竭中龍血素B的含量，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，表明所建立的HPLC法專屬性強(qiáng)、陰性無(wú)干擾，方法穩(wěn)定可靠，且操作方便、快捷，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。

3.2文獻(xiàn)［8-11］采取的流動(dòng)相大都是乙腈-冰醋酸（1→90）水溶液系統(tǒng)（40∶60），而本實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-冰醋酸（1→90）水溶液系統(tǒng)和乙腈-冰醋酸（1→900）水溶液系統(tǒng)，結(jié)果后者作為流動(dòng)相時(shí)，龍血素B約在25 min出峰，分離度較好，色譜峰峰形較好，且較穩(wěn)定，能夠滿足色譜定量要求。

3.3根據(jù)文獻(xiàn)［10］的供試品溶液制備方法，分別對(duì)供試品提取量（2.0 g，3.0 g，5.0 g，10.0 g），提取方式（超聲提取、回流提?。?，提取時(shí)間（30 min，1 h，1.5 h，2 h）以及提取溶劑量（15 ml，20 ml，25 ml，30 ml）進(jìn)行考察，結(jié)果確定供試品提取方法為：精密稱取黃金甲跌打生肌膏3.0 g，精密加入甲醇25 ml，于100℃水浴上回流1 h。

［1］王錦亮，李興從，江東福，等.云南血竭的化學(xué)成分及抗真菌活性［J］.云南植物研究，1995，17（3）：336-340.

［2］胡迎慶，官飆，屠鵬飛.龍血樹(shù)屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：植物藥分冊(cè)，2000，15（1）：5.

［3］盧文杰，王雪芬，脒家源，等.劍葉龍血樹(shù)氯仿部分化學(xué)成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1998，33（10）：755.

［4］張慶云，朱輝，陳紅英，等.龍血竭研究進(jìn)展［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，13（1）：69.

［5］張靜澤，胡迎慶，郭鵬.紫外分光光度法測(cè)定龍血竭中二氫查耳酮的含量［J］.中成藥，2004，6（26）：505.

［6］周志宏，王錦亮，楊崇仁.國(guó)產(chǎn)血竭的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2001，32（6）：484-485.

［7］王雪芬，盧文杰，陳家源，等.劍葉龍血樹(shù)化學(xué)成分研究［J］.廣西中醫(yī)藥，1993，16（1）：38-39.

［8］黃涵琦，張曉燕.HPLC測(cè)定龍血竭膠囊中龍血素B的含量［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009，11（6）：1045-1046.

［9］李忠瓊，向東.HPLC測(cè)定龍血竭中龍血素A和龍血素B的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2005，20（4）：348-349.

［10］黃韻然，梁美宜，周毅生，等.HPLC法測(cè)定龍血竭結(jié)腸定位片中龍血素B的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27 （4）：329-331.

［11］蔣林，吳玉強(qiáng)，楊興，等.高效液相色譜法測(cè)定龍血竭丸中龍血素B的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（3）：552-553.

（編輯陳明偉）

理論探討

R284.1

A

2095-4441（2015）03-0054-04

2015-05-28