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        耳草提取物的抑菌作用及急性毒性研究

        2015-09-28 08:20:00朱智德羅宇東劉源煥
        關(guān)鍵詞:沙門(mén)銅綠埃希菌

        朱智德,羅宇東,劉源煥,李 娜

        (廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠,廣西 南寧 530023)

        耳草提取物的抑菌作用及急性毒性研究

        朱智德,羅宇東,劉源煥,李娜

        (廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠,廣西南寧530023)

        [目的]研究耳草提取物的抑菌作用及急性毒性。[方法]運(yùn)用瓊脂平板結(jié)合試管二倍稀釋法觀察耳草提取物(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇、水提取物)對(duì)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌等的抑制作用;急性毒性試驗(yàn)采用小鼠灌胃法,測(cè)定耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量。[結(jié)果]體外抑菌試驗(yàn)表明,耳草水、乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制作用;系統(tǒng)溶劑提取物中,乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌的作用,而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明顯。急性毒性試驗(yàn)表明耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg。[結(jié)論]耳草提取物具有抑菌作用,水提取物及乙醇提取物的急性毒性很小。

        耳草;提取物;抑菌作用;急性毒性

        耳草為茜草科植物耳草Hedyotis hedyotidea(Dc.)Merr.的全草,別名較剪草、鯽魚(yú)膽草、細(xì)葉亞婆巢、節(jié)節(jié)花等,具有散瘀消腫、清熱解毒之效,對(duì)感冒發(fā)熱、咽喉痛、咳嗽、腸炎、痢疾、瘡癤和蛇咬傷均有較好的療效。耳草產(chǎn)于我國(guó)南部和西南部各省區(qū),為廣西少數(shù)民族(壯瑤)地區(qū)民間廣泛使用的藥材。文獻(xiàn)報(bào)道耳草具有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用[1-5]。本文對(duì)其抑菌作用及急性毒性進(jìn)行研究,為耳草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1動(dòng)物昆明系小鼠,雌雄各半,體重18~22 g,購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,清潔級(jí),合格證號(hào):SCXK桂2014-0002。

        1.2菌株、菌液銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)由南寧市第四人民醫(yī)院微生物室提供,金黃色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、沙門(mén)菌(Salmonella)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院,菌種批號(hào)分別為:26003-5a23-2、44102-3a14、50094-1a5。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn),批號(hào):140819);營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn),批號(hào):140806)。菌液制備:挑取以上菌株的菌落,接種于肉湯培養(yǎng)管中,37℃培養(yǎng)24 h后,用生理鹽水稀釋為106CFU/ml的試驗(yàn)菌液備用。

        1.3試藥耳草采自廣西上林縣,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為茜草科耳草屬植物耳草Hedyotis hedyotidea (DC.)Merr.的干燥藤莖。

        1.4主要試劑及儀器JY501電子天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司);101-1恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);RE501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司);XFS-280壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司);LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1耳草提取物的制備

        2.1.1耳草水提物(A)藥材粉碎,加水煎煮3次,每次1 h,過(guò)濾,濾液濃縮至浸膏(A),每克浸膏相當(dāng)于藥材量2.5 g,批號(hào):20131201。

        2.1.2耳草乙醇提取物(B) 耳草粉碎成細(xì)粉(100目),加入75%乙醇回流提取2次(每次8倍量,2 h),提取液抽濾,揮去乙醇,蒸干得浸膏(B),每克浸膏相當(dāng)于原藥材2.0 g,批號(hào):20131202。

        2.1.3耳草系統(tǒng)溶劑提取物(C~G)藥材粉碎(100目),按系統(tǒng)溶劑提取法分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取,提取液濾過(guò),蒸干得稠膏。石油醚(G)、氯仿(F)、乙酸乙酯(E)、正丁醇(D)、甲醇(C)提取物相當(dāng)?shù)乃幉牧糠謩e為750,210,350,70,15 g/g(稠膏/藥材)。

        上述提取物均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠制備,實(shí)驗(yàn)時(shí)配制成所需濃度。

        2.2抑菌作用試驗(yàn)[6-9]取1 ml小試管若干支,將耳草不同溶劑提取物(A~G)分別按試管稀釋法等倍稀釋?zhuān)?/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64,1/128),制備得系列濃度為90,45,22.5,11.3,5.6,2.8,1.4 mg/ml的供試液,每支試管中接種相應(yīng)的試驗(yàn)菌液各50 μl,混合均勻,置37℃培養(yǎng)24 h,然后再?gòu)拿恳恢г嚬苤腥?0 μl培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,均勻涂布,培養(yǎng)24 h(37℃),觀察各平板上細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,以此計(jì)算藥物的最小抑菌濃度(MIC)。藥物的最小抑菌濃度指不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋度。平行試驗(yàn)3次,以2次或者3次結(jié)果相同為有效。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

        表1 耳草水、乙醇提取物對(duì)各菌株的MIC測(cè)定結(jié)果?。╩g/ml)

        表2 耳草系統(tǒng)溶劑提取物對(duì)各菌株的MIC測(cè)定結(jié)果?。╩g/ml)

        由表1可見(jiàn),耳草水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的MIC分別為2.8,5.6,45,45 mg/ml;耳草乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的MIC分別為5.6,2.8,45,45 mg/ml??梢?jiàn)耳草乙醇、水提取物對(duì)上述受試細(xì)菌有一定的抑制作用。

        由表2可見(jiàn),耳草不同極性溶劑的提取物中,甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的MIC分別為5.6,2.8,11.3,11.3 mg/ml;正丁醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的MIC分別為5.6,11.3,45,22.5 mg/ml;乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌的MIC分別為11.3,11.3,45,22.5 mg/ml;可見(jiàn)耳草的甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物對(duì)上述受試細(xì)菌均有抑制作用。石油醚、氯仿提取物則對(duì)上述受試細(xì)菌無(wú)抑制效果。2.3耳草急性毒性試驗(yàn)[10-11]取60只小鼠,體質(zhì)量18~22 g,雌雄各半,隨機(jī)分為3組,即空白對(duì)照組、耳草水提組、耳草醇提組,每組20只小鼠。小鼠禁飼(供水)20 h后,以耳草水提物最大濃度(2.5 g/ml)、醇提物最大濃度(3.7 g/ml)分別灌胃給予受試藥液,一天灌胃2次(上午8時(shí)和下午3時(shí),給藥體積均為40 ml/kg,空白對(duì)照組灌胃等量飲用水,觀察給藥后14天內(nèi)小鼠的體重、外觀、行為、呼吸、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、排泄、死亡等情況。14天后解剖小鼠,觀察組織臟器有無(wú)異常改變。

        結(jié)果顯示,給藥后14天內(nèi)小鼠的外觀、行為、呼吸、四肢活動(dòng)、進(jìn)食、排泄等均未見(jiàn)明顯異常,無(wú)死亡現(xiàn)象;給藥組與空白對(duì)照組小鼠體質(zhì)量比較無(wú)顯著性差異。14天后解剖小鼠,觀察主要組織臟器,給藥組與空白對(duì)照組比較,動(dòng)物均無(wú)異?,F(xiàn)象。測(cè)定耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg,提示耳草的急性毒性很小。結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 耳草對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量的影響?。ā纒)

        表3 耳草對(duì)小鼠急性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量的影響 (±s)

        組 別 n 給藥濃度(g/ml) 給藥量(ml/kg) 給藥前體質(zhì)量(g) 給藥14天體質(zhì)量(g) 增長(zhǎng)率(%)空白對(duì)照組 20 — 40 20.15±1.12 28.60±1.70 41.93耳草水提組 20 2.5 40 20.21±1.08 29.15±1.80 44.24耳草醇提組 20 3.7 40 20.05±1.06 29.50±2.05 47.13

        3 討論

        3.1耳草在兩廣地區(qū)廣泛應(yīng)用,是嶺南著名的抗炎鎮(zhèn)痛和傷科用藥。國(guó)內(nèi)對(duì)耳草的藥理研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,表明其具有抗炎鎮(zhèn)痛等作用,但對(duì)其抑菌作用及急性毒性研究方面的報(bào)道卻很少,為此本文開(kāi)展了耳草抑菌作用及急性毒性試驗(yàn)研究。體外抑菌試驗(yàn)表明,耳草水、乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有不同程度的抑制作用;系統(tǒng)溶劑提取物中,乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)菌的作用,而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明顯。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,耳草水提取物、乙醇提取物的最大給藥量為252.4 g/kg、336.6 g/kg,提示耳草的毒性很低。

        3.2國(guó)內(nèi)報(bào)道耳草含有β-谷甾醇、莨菪亭、表白樺脂酸、羽扁豆醇、齊墩果酸、咖啡酸、揮發(fā)油等成分[1-5]。本研究表明耳草提取物體外試驗(yàn)具有一定的抑菌效果,但考慮到中藥材的體內(nèi)及體外抑菌作用差別較大,耳草是否具有體內(nèi)抑菌作用還有待進(jìn)一步的研究。

        [1]陶曙紅,陳艷芬,李鐘,等.耳草抗炎活性化學(xué)成分的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2011,27(4):364-366.

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        [3]陶曙紅,張少逵,袁旭江.耳草葉揮發(fā)油化學(xué)成分的GCMS分析[J].中成藥,2010,32(3):511-512.

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        (編輯陳明偉)

        R285.5

        A

        2095-4441(2015)03-0052-03

        2015-08-01

        廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專(zhuān)項(xiàng)課題(編號(hào):GZZY13-14)

        朱智德,博士研究生,副教授,研究方向:藥品、食品研究開(kāi)發(fā)

        羅宇東,E-mail:1097201466@qq.com

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