沈一偉，程　蕾，邱曉曉，程　涇，孫永忠

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州　310053；2.溫州中山醫(yī)院，浙江 溫州　325014）

實驗研究

滋陰抑亢調(diào)沖湯對卵巢過度刺激綜合征模型大鼠囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子的影響

沈一偉1，程蕾2，邱曉曉2，程涇2，孫永忠2

（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州310053；2.溫州中山醫(yī)院，浙江 溫州325014）

［目的］觀察滋陰抑亢調(diào)沖湯對卵巢過度刺激綜合征模型大鼠腹腔毛細血管通透性、血清雌二醇（E2）含量及卵巢組織囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（CFTR）水平的影響，探討其對卵巢過度刺激綜合征的療效及機制。［方法］20日齡Wistar大鼠60只，隨機分成正常組、模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組及吲哚美辛組，每組15只。除正常組，另三組采用孕馬血清促性腺激素＋人絨毛膜促性腺激素建立卵巢過度刺激綜合征大鼠模型。分別給予生理鹽水、滋陰抑亢調(diào)沖湯或吲哚美辛灌胃，采用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠血清雌二醇含量、免疫組織化學方法及免疫印跡法檢測大鼠卵巢組織中CFTR的表達。［結(jié)果］滋陰抑亢調(diào)沖湯效果與吲哚美辛類似，能顯著降低大鼠血清E2含量（P＜0.01）、卵巢組織CFTR蛋白的表達（P＜0.01），且在降低腹腔毛細血管通透性方面優(yōu)于吲哚美辛（P＜0.05）。［結(jié)論］滋陰抑亢調(diào)沖湯可能通過降低血清E2水平、降調(diào)卵巢組織CFTR蛋白表達及改善腹腔毛細血管的通透性發(fā)揮治療卵巢過度刺激綜合征的作用。

滋陰抑亢調(diào)沖湯；卵巢過度刺激綜合征；囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子

卵巢過度刺激綜合征（OHSS）是采用促排卵藥物尤其是行輔助生殖技術(shù)（ART）超促排卵治療不孕癥患者時出現(xiàn)的嚴重醫(yī)源性并發(fā)癥。據(jù)文獻報道OHSS總體發(fā)生率大約是20%，其中輕度20%～30%，中度3%～6%，重度0.1%～2%［1］。目前OHSS的發(fā)病機理尚未明確，治療棘手，近來一些研究提示OHSS的發(fā)生可能與體內(nèi)囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)器（cys tic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）［2-3］的異常高表達有關(guān)。臨床驗方——滋陰抑亢調(diào)沖湯用于治療卵巢過度刺激綜合征患者取得較好療效［4］，本研究通過建立大鼠OHSS模型，觀察大鼠卵巢中CFTR的改變，探討滋陰抑亢調(diào)沖湯抗OHSS的細胞因子調(diào)控機制，為臨床進一步運用中醫(yī)中藥治療OHSS奠定實驗學基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用健康雌性20日齡Wistar大鼠60只，體重45～50 g，SPF級，溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：CSXK（滬）2012-0002。均適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后22日齡時開始實驗。

1.2實驗試劑、藥品及儀器孕馬血清促性腺激素（PMSG），每支1 000 IU，購于寧波市第二激素廠，生產(chǎn)批號為140825；人絨毛膜促性腺激素（hCG），每支2 000 IU，購于麗珠制藥廠，生產(chǎn)批號為140508；吲哚美辛腸溶片，每年25 mg，購于山西云鵬制藥廠，批號為A131101；滋陰抑亢調(diào)沖湯（由生地黃、地骨皮、牡丹皮、山藥、白術(shù)、知母、黃柏、女貞子、墨旱蓮、當歸、黃芩、赤芍、陳皮、龜板、茯苓、澤瀉、丹參、八月札、白茅根、大腹皮等中藥組成）由溫州中山醫(yī)院中國中西醫(yī)結(jié)合學會生殖醫(yī)學不孕不育研究所提供、濃煎制備，按人鼠體重比例換算后乘以人與大鼠體重換算系數(shù)6.25，換算后按4.25 g/ml灌胃；721型分光光度計（上海第三分析儀廠）；雷勃MK3酶標儀（上海博蘊公司）；RM2016切片機（德國徠卡公司）；BX51T-PHD-J11雙目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；xh6080放免儀（西安核儀廠）；COX-2免疫組化試劑盒（Bioworld公司）；ELISA試劑盒（VEGF）（上海博蘊生物公司）；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；AE100型電子天平（瑞士METTER公司）。

1.3分組與造模大鼠隨機分為4組，各15只，分別為正常組、模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組。除正常組外，其余采用改良后的Ujioka［5］方法，皮下注射PMSG聯(lián)合hCG建立OHSS大鼠模型。正常組第22～26日齡經(jīng)皮下注射生理鹽水0.1 ml/d，連續(xù)5 d，模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組三組均從大鼠第22日齡起皮下注射含有PMSG 10 IU的生理鹽水0.1 ml，連續(xù)4 d，第5天即第26日齡經(jīng)皮下注射含有100 IU hCG的生理鹽水0.1 ml。根據(jù)Golan等［6］提出的OHSS診斷標準，卵巢體積明顯增大，表面紫褐色，多發(fā)囊腫突出，腹水明顯，表明模型建立成功，即可診斷為OHSS。

1.4給藥方法各組均于26日齡（即在注射hCG/生理鹽水前1 h）開始灌胃，正常組和模型組每天用生理鹽水灌胃1 ml，滋陰抑亢調(diào)沖湯組每天采用中藥灌胃4.25 g/100 g，吲哚美辛組用含有0.5 mg/ml吲哚美辛的生理鹽水每天灌胃0.5mg/100 g，均連續(xù)灌胃1周。

1.5標本采集及指標測定連續(xù)灌胃1周后（即33日齡），按0.1 mg/kg肌肉注射氯胺酮麻醉大鼠，尾靜脈注射1%的亞甲藍0.1 ml。30 min后從大鼠心臟采血3 ml于試管中，待血液標本凝固后離心（3 000 r/min）10 min，吸取上部血清置于-20℃保存待檢，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定血清E2。隨后脫頸處死大鼠，正中切開腹腔，抽吸5 ml生理鹽水沖洗，收集腹腔沖洗液，再用生理鹽水稀釋至10 ml，加0.1 mol/L氫氧化鈉0.05 ml清除蛋白質(zhì)造成的混濁，并以3 000 r/min的速度離心10 min。然后用分光光度計（國產(chǎn)721型）在波長660 nm測定OD值，根據(jù)標準曲線計算腹腔沖洗液亞甲藍濃度。隨后取出雙側(cè)卵巢組織，用生理鹽水清洗干凈、稱重。一側(cè)卵巢用4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，5～7 μm連續(xù)切片，用于免疫組化染色；另一側(cè)卵巢-70℃冰箱保存，待行Western Blot（WB）檢測。因?qū)嶒炛写笫笏劳龌虿裳獣r血量不足，各組選取10份標本待檢。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行分析。實驗有關(guān)數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，并用均數(shù)±標準差（±s）表示。多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。方差齊性者各指標多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnett’s T3檢驗。非參數(shù)檢驗，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，多組間兩兩比較采用Wilcoxon秩和檢驗。以P＜0.05為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1藥物治療對大鼠卵巢重量及腹腔沖洗液亞甲藍含量的影響各組大鼠卵巢重量、腹腔沖洗液亞甲藍含量見表1。

表1　四組大鼠雙側(cè)卵巢重量、腹水沖洗液亞甲藍含量

與正常組相比，模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組大鼠雙側(cè)卵巢重量均明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，滋陰抑亢調(diào)沖湯組與吲哚美辛組大鼠雙側(cè)卵巢重量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組大鼠的腹腔沖洗液亞甲藍含量較正常組顯著增多（P＜0.01）。與模型組比較，滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組的腹腔沖洗液亞甲藍含量均明顯下降（P＜0.01），其中滋陰抑亢調(diào)沖湯組下降更為明顯（P＜0.05）。

2.2各組大鼠卵巢組織形態(tài)學變化在光鏡下觀察HE染色卵巢。正常組大鼠卵巢可見各個發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)可見卵母細胞、放射冠，顆粒細胞排列整齊，卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞分布均勻，未見增生。模型組大鼠卵巢明顯腫脹、體積增大，在卵巢皮質(zhì)內(nèi)可見部分發(fā)育期卵泡、多發(fā)性的卵泡囊腫及黃體囊腫，黃素化明顯，間質(zhì)水腫，卵泡呈多囊性擴張。吲哚美辛組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組大鼠卵巢形態(tài)與模型組類似，相比之下，卵泡囊腫及黃體、黃體囊腫數(shù)目有不同程度的減輕，可見間質(zhì)水腫，卵巢內(nèi)見黃體形成，詳見圖1。

圖1　卵巢HE染色

2.3藥物治療對大鼠血清E2的影響見表2。與正常組相比，滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組及模型組中大鼠血清E2水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，滋陰抑亢調(diào)沖湯組血清E2明顯下降（P＜0.01），吲哚美辛組血清E2水平也有下降（P＜0.05）。

表2　四組大鼠血清雌二醇（E2）含量

2.4藥物治療對大鼠卵巢組織CFTR的影響

2.4.1免疫組化結(jié)果結(jié)果如圖2示。四組大鼠卵巢組織黃體中均可見CFTR呈棕黃色顆粒表達于黃體細胞的胞質(zhì)中，且模型組的CFTR表達強度顯著高于其余三組。

采用半定量積分法，觀察免疫組化結(jié)果。陽性細胞著色強度以大多數(shù)陽性細胞為準，并參考背景呈色，分為0分、1分、2分、3分；陽性細胞比例以每10個高倍視野的細胞計數(shù)為準，陽性細胞占計數(shù)細胞比例＜30%者為1分，30%～70%者為2分，≥70%者為3分。根據(jù)陽性細胞比例及陽性細胞著色強度兩項分數(shù)之和，確定其陽性程度：0分為陰性（-）；2分為弱陽性（+）；3～4分為陽性（++）；5～6分為強陽性（+++）［7］。結(jié)果見表3，采用秩和檢驗進行統(tǒng)計學分析。模型組、滋陰抑亢調(diào)沖湯組、吲哚美辛組CFTR蛋白表達均強于正常組（P＜0.01），模型組表達強于滋陰抑亢調(diào)沖湯組與吲哚美辛組（均P＜0.05），但滋陰抑亢調(diào)沖湯組與吲哚美辛組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2　四組大鼠卵巢組織中CFTR的免疫組化結(jié)果（×400）

表3　四組大鼠卵巢組織中CFTR的不同強度表達（只）

2.4.2WB檢測結(jié)果各組大鼠卵巢組織均可在分子量170 KD處檢測到CFTR蛋白條帶（見圖3），四組大鼠卵巢組織CFTR與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度的比值見表4。WB定量結(jié)果顯示CFTR在卵巢組織的表達：正常組明顯低于其他三組（P＜0.01），模型組明顯高于滋陰抑亢調(diào)沖湯組和吲哚美辛組（均P＜0.01）。WB結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。

3　討論

OHSS是一種醫(yī)源性疾病，是指由促排卵藥物誘發(fā)排卵而引起的癥候群，嚴重的OHSS可危及生命。由于近30年來，輔助生殖技術(shù)迅速發(fā)展，LHRH-a-FSH/HMG-hCG超促排卵藥物引起的OHSS發(fā)生率明顯上升，如何有效控制疾病的發(fā)展，同時提高患者受孕率成為新的課題。OHSS最主要和最具特征的表現(xiàn)為卵巢體積增大、水腫（胸腹水）、多發(fā)性黃素化囊腫形成，OHSS臨床分級的主要指標之一是卵巢體積及E2水平的高低。

以往的研究普遍認為卵巢囊性增大與水腫形成主要與VEGF等因子有關(guān)［8］。2005年Ajonuma等［3］用RT-PCR和Western Blot及電生理技術(shù)檢測到OHSS成年SD大鼠卵巢模型有CFTR mRNA和蛋白表達增加，并有氯離子通道活動的亢進，提示CFTR可能與OHSS的發(fā)病機制有關(guān)。

圖3　四組大鼠卵巢組織中CFTR的WB檢測

表4　四組大鼠卵巢組織CFTR與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度的比值

CFTR是一種cAMP依賴的跨膜氯離子通道蛋白，存在于多種組織、器官如呼吸道、消化道、生殖道、汗腺等的上皮細胞頂側(cè)膜。氯離子是組織中含量最多的陰離子，氯離子通道在細胞容積調(diào)節(jié)、跨上皮細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)及細胞興奮性調(diào)節(jié)等過程中，發(fā)揮重要作用。當cAMP濃度升高時，CFTR蛋白構(gòu)型改變、通道開放、氯離子外流。陰離子的主動運輸促使陽離子分泌，進而導致水沿著滲透梯度排放，在跨上皮細胞鹽類轉(zhuǎn)運、水分流動和離子濃度調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［9］。而CFTR基因突變可引起囊性纖維化癥，由于CFTR蛋白缺失或功能異常，氯離子轉(zhuǎn)運障礙，導致水分流失和分泌物稠厚，如女性CFTR基因突變的患者生育率下降［10］，多認為是由于宮頸液黏稠所致精子不易穿透而造成的。

本實驗表明，大鼠正常卵巢組織中有CFTR的表達，且模型組卵巢中的CFTR表達強度顯著高于其余三組，與Ajonuma等［3］的實驗結(jié)果一致，提示體內(nèi)高表達的CFTR與OHSS存在相關(guān)性。且四組間血E2的水平比較差異有統(tǒng)計學意義，模型組的E2水平明顯高于其他三組，表明卵巢CFTR表達的變化與體內(nèi)E2水平有關(guān)，E2可能刺激卵巢黃體細胞表達CFTR蛋白。在外源性hCG刺激下，E2水平升高，其通過自分泌和旁分泌方式刺激CFTR表達量增加、氯離子通道活動亢進，導致液體積聚于腔內(nèi)形成卵泡囊腫和黃體囊腫，導致卵巢體積增大、間質(zhì)水腫［2］。

程涇等［11］首先提出OHSS病因病機應(yīng)為外來因素（外源性促性腺激素類似“陽邪”）刺激，致使體內(nèi)陽熱亢盛（以雌激素為主的激素分泌亢進），傷及腎陰，耗損陰液，虛火上炎，陽熱充斥，進而氣血瘀滯，致使三焦水液敷布失調(diào)，而水濕停滯，臟腑功能紊亂，損傷沖任、胞脈胞絡(luò)，發(fā)為OHSS。本病辨證為陰虛陽盛，氣血瘀阻，痰濕阻滯，以滋陰清熱抑陽、行氣化瘀、利濕調(diào)沖為治療原則，組方滋陰抑亢調(diào)沖湯治療。

本實驗證實滋陰抑亢調(diào)沖湯能有效降低大鼠體內(nèi)E2水平，減少大鼠卵巢組織中CFTR的表達，降低腹腔毛細血管通透性、減輕腹水，改善卵巢過度刺激癥狀，為臨床進一步應(yīng)用提供實驗學依據(jù)。

［1］Nastri C O，F(xiàn)erriani R A，Rocha I A，et al.Ovarian hyperstimulation syndrome：pathophysiology and prevention［J］. Journal of assisted reproduction and genetics，2010，27（2-3）：121-128.

［2］靳鐳，湯瑞玲.囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)器在卵巢過度刺激綜合征模型大鼠卵巢中表達的變化［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2007，36（5）：642-643.

［3］Ajonuma L C，Tsang L L，Zhang G H，et al.Estrogeninduced abnormally high CFTR expression results in ovarian hyperstimulation syndrome［J］.Mol Endocrinol，2005，19 （12）：3038.

［4］朱長玲，盧帥軍，程涇.滋陰抑亢調(diào)沖湯治療卵巢過度刺激綜合征200例［J］.浙江中醫(yī)雜志，2010，45（6）：407.

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［11］程涇，王衛(wèi)芳，盧曉玲，等.中西醫(yī)結(jié)合治療卵巢過度刺激綜合征61例［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，19 （11）：687.

（編輯湯敏華）

Effect of Ziyinyikangtiaochong Decoction on Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator in Model Rats of Ovarian Hyperstimulation Syndrome

SHEN Yi-wei1，CHENG Lei2，QIU Xiao-xiao2，CHEN Jing2，SUN Yong-zhong2
（1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang，310053；2.Wenzhou Zhongshan Hospital，Wenzhou，Zhejiang，325014）

［Objective］To observe the Effect of Ziyinyikangtiaochong decoction on capillary permeability，the content of E2and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（CFTR）in model rats of ovarian hyperstimulation syndrome so as to explore efficacy and mechanism of the decoction.［Method］Sixty Wistar rats of 20-day-old were randomly divided into normal group，model group，Ziyinyikangtiaochong decoction group and indomethacin group with 15 rats each group.Except for normal group，the other three groups were inclined to use pregnant mare serum gonadotropin and human chorionic gonadotropin to set up the ovarian hyperstimulation syndrome model.They were lavaged with saline，Ziyinyikangtiaochong decoction or indomethacin.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect content of E2and immunohistochemistry and immunoblotting were used to detect the expression of CFTR in ovarian tissue for the rats.［Results］The effect of Ziyinyikangtiaochong decoction，which is similar to that of indomethacin，could reduce the content of E2and expression of CFTR in ovarian tissue significantly（P＜0.01）.And the efficacy of the decoction for lowering abdominal capillary permeability is obviously superior to that of indomethacin（P＜0.05）.［Conclusion］Ziyinyikangtiaochong decoction can treat ovarian hyperstimulation syndrome through reducing the content of E2and expression of CFTR in ovarian tissue and improving abdominal capillary permeability.

Ziyinyikangtiaochong decoction；ovarian hyperstimulation syndrome；cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

R285.5

A

2095-4441（2015）03-0001-04

2015-06-30

浙江省中醫(yī)藥科技計劃（編號：2015ZA201）；溫州市科技計劃項目（編號：Y20140219）

沈一偉（1990-），女，漢族，浙江溫州市人，在讀研究生，研究方向：不孕不育的中醫(yī)藥研究

孫永忠，E-mail：zsyy007@126.com