顧進(jìn)寶， 陽立波， 曹樹青

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

隨著地球生態(tài)環(huán)境的日益惡化，植物要面對多種脅迫條件，因此研究植物抗逆機(jī)制以幫助植物度過難關(guān)十分必要。擬南芥對干旱脅迫的耐受主要通過減少蒸騰、節(jié)約用水、增加水分來源3條途徑［1］。擬南芥可通過調(diào)節(jié)氣孔開閉來減少蒸騰失水，也可通過減緩植物生長發(fā)育過程，體現(xiàn)為植物生長較小，且會較快進(jìn)入生殖生長，干旱環(huán)境還能促進(jìn)植物根系向四周生長以吸收更多水［1］。擬南芥調(diào)節(jié)干旱耐受的分子機(jī)制主要通過甲基化（去甲基化）修飾、植物激素（ABA、IAA等）相關(guān)代謝途徑［2］、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族（DREB、MYB／MYC、NAC等［3－6］）、蛋白激酶［7］和某些共激活因子［8］的表達(dá)等進(jìn)行調(diào)節(jié)，且各調(diào)節(jié)機(jī)制不一定能相互疊加以增強(qiáng)干旱耐受或敏感的效應(yīng)［9］，而是在一個(gè)有機(jī)整體內(nèi)通過很多代謝途徑共同調(diào)控完成［10］。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中篩選得到一個(gè)具有干旱耐受表型的突變體lwt2－1，通過對該突變體的研究，揭示植物在干旱脅迫耐受過程中某些未知的調(diào)控機(jī)制。本文通過構(gòu)建該突變體的互補(bǔ)材料和相應(yīng)基因的過表達(dá)材料，為該突變體的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞野生型（Col－0），購于美國擬南芥種質(zhì)資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室繁衍保存。

1.1.2 主要試劑

TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pEASY－blunt ZERO Cloning Kit購于北京全式金公司，總RNA抽提試劑盒、Taq PCR Master－Mix百泰克、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SacⅠ和EcoRⅠ、高保真酶Phusion、T4DNA連接酶購于NEB公司。

1.1.3 宿主菌和載體

平末端載體pEASY－blunt ZERO Cloning Kit和感受態(tài)細(xì)胞Trans1－T1Chemically Competent Cell（購自全式金公司）?；パa(bǔ)載體pCAMBIA 1301，過表達(dá)載體pCAMBIA 130135SN。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥植株培養(yǎng)

將種子用5%次氯酸鈉浸洗7min，用無菌水洗5次以除去殘留次氯酸鈉液，然后將種子點(diǎn)于1／2MS固體培養(yǎng)基上，于4℃春化3d，最后置于正常培養(yǎng)條件下（光強(qiáng)度為100μmol／（m2·s）、光周期為16／8h、培養(yǎng)溫度為23℃）培養(yǎng)14d后移栽至小盆中。

1.2.2 擬南芥LWT2基因克隆

植物總RNA抽提試劑盒抽提組織中總RNA，詳細(xì)方法見說明書。

以總RNA為模板，用TransScript One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。植物基因組DNA用CTAB法提取。

根據(jù)TAIR中提供的基因gDNA和cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并正向和反向引物的5′端加上所需的酶切位點(diǎn)和相應(yīng)保護(hù)堿基。過表達(dá)載體選用BamHⅠ、SacⅠ，互補(bǔ)載體選用BamHⅠ、EcoRⅠ。

分別以gDNA和cDNA為模板，用Pusion高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并回收純化目的條帶。

將回收純化的相應(yīng)片段與pEASY－blunt ZERO Cloning Kit平末端載體連接［11］，轉(zhuǎn)入Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞中，用含有50μg／mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并選取正確克隆接種于50μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16h。用百泰克質(zhì)粒小抽提取質(zhì)粒并測序。測序正確的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切下目的條帶后用膠回收方法純化后分別連接至pCAMBIA 1301和pCAMBIA 130135SN。

1.2.3 互補(bǔ)和過表達(dá)載體的構(gòu)建

測序正確的質(zhì)粒用對應(yīng)的酶切下目的條帶后用膠回收方法純化。回收片段連接至相應(yīng)載體，轉(zhuǎn)入Trans T1菌株中，用含有50μg／mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并選取正確克隆接種于50μg／mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16h。用百泰克質(zhì)粒小抽提取質(zhì)粒并測序。選擇正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌菌株，用含有50μg／mL卡那霉素和50μg／mL利福平的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并選取正確克隆接種于50μg／mL卡那霉素和50μg／mL利福平的LB液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)至OD值為1.6左右，再用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥［12］。

1.2.4 陽性苗及單插入篩選

將轉(zhuǎn)化的擬南芥種子撒到含有30μg／mL潮霉素的1／2MS板上純化3d后正常培養(yǎng)14d，長出真葉和根的作為T1植株進(jìn)行移栽。

將篩選的陽性苗種下后收到種子T2，再用潮霉素篩選鑒定分離比，選取潮霉素耐受（HygR）比對潮霉素敏感（HygS）的個(gè)數(shù)比為3∶1的T2進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增擬南芥LWT2基因

提取擬南芥基因組DNA（gDNA）和RNA，RNA用RT Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別以gDNA和cDNA為模板擴(kuò)增LWT2基因片段。電泳結(jié)果與目的片段大小一致。LWT2基因全長如圖1a所示，長度為2556bp。LWT2CDS全長如圖1b所示，長度為459bp。

圖1 電泳檢測PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 LWT2基因連接轉(zhuǎn)化與鑒定

將目的基因與pEasy－blunt載體連接并導(dǎo)入大腸桿菌 Trans1－T1感受態(tài)細(xì)胞中，用含50μg／mL Kanamycin的LB平板篩選陽性單克隆。挑取單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR，電泳檢測分析。擴(kuò)增出的條帶均為陽性結(jié)果，如圖2所示。用含有50μg／mL Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后提質(zhì)粒測序。

圖2 重組質(zhì)粒菌落PCR結(jié)果電泳檢測

2.3 最終載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SacⅠ互補(bǔ)中間載體和pCambia 1301；用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ過表達(dá)中間載體和pCambia 130135SN，回收正確片段后分別與對應(yīng)載體用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有50μg／mL Kanamycin的LB平板篩選陽性單克隆。菌落PCR鑒定后搖菌提質(zhì)粒測序。菌落PCR鑒定結(jié)果如圖3所示。

圖3 載體酶切回收后電泳檢測結(jié)果

2.4 純和轉(zhuǎn)基因植株

將獲得測序正確的質(zhì)粒用熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株的感受態(tài)細(xì)胞中，用含有50μg／mL卡那霉素和50μg／mL利福平的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌液PCR鑒定陽性菌驗(yàn)證

選取正確克隆接種于50μg／mL卡那霉素和 50μg／mL利福平的LB液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)至OD值1.6左右，再用浸花轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥。將轉(zhuǎn)化的擬南芥種子撒到含有30μg／mL潮霉素的1／2MS板上純化3d后正常培養(yǎng)14d，挑取長出真葉與根的T1代植株進(jìn)行移栽。剪下部分葉片提取DNA和RNA，分別在基因組水平上和轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因的表達(dá)，檢測結(jié)果如圖5所示。

圖5 LWT2轉(zhuǎn)基因植株T1代陽性苗轉(zhuǎn)錄水平的鑒定

選擇正確的陽性苗單株收種子T2，用含有30μg／mL潮霉素的1／2MS板篩選，選擇分離比為3∶1（單插入）的T2種子，選擇對應(yīng)單插入的陽性植株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3 討 論

對植物來說，環(huán)境壓力越來越大。研究植物抗逆機(jī)制對提高植物適應(yīng)環(huán)境能力起重要作用。雖然不同物種中代謝途徑的上下游會有差異，但并不影響對基因功能的研究。通過了解植物不同抗逆途徑，可以減少與植物抗逆負(fù)相關(guān)的因素，提高正相關(guān)的因素來提高植物的抗逆能力。本文通過遺傳學(xué)方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料，研究LWT2基因在干旱脅迫調(diào)控過程中的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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