李　春，周為軍，宋朝輝，李朝陽，余　萍，曾學(xué)文，郭智龍

（新疆自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科新疆烏魯木齊830000）

·基礎(chǔ)研究·

活化轉(zhuǎn)錄因子3、4和ki-67在皮膚鱗癌中的表達(dá)意義

李春，周為軍，宋朝輝，李朝陽，余萍，曾學(xué)文，郭智龍

（新疆自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科新疆烏魯木齊830000）

目的：探討活化轉(zhuǎn)錄因子3、4和ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法：從筆者所在醫(yī)院病理科儲(chǔ)存的蠟塊中隨機(jī)選擇96例皮膚鱗癌和118例基底細(xì)胞癌標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)組織中活化轉(zhuǎn)錄因子3、4和ki-67的表達(dá)，分析其表達(dá)意義。結(jié)果：活化轉(zhuǎn)錄因子3、4在皮膚鱗癌中的表達(dá)較基底細(xì)胞癌高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.003和0.001）。Ki-67在兩種皮膚癌中的表達(dá)無顯著差異（P值為0.718）。ATF3、4的表達(dá)強(qiáng)度和皮膚鱗癌分化程度成正相關(guān)，即分化程度低越低，表達(dá)強(qiáng)度越高（r=0.395P=0.000和r=0.303P=0.001）。結(jié)論：活化轉(zhuǎn)錄因子3、4可以作為鑒別皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌可靠的蛋白標(biāo)記物和皮膚鱗癌惡性程度及預(yù)后的判斷指標(biāo)。

皮膚鱗癌；基底細(xì)胞癌；免疫組化；活化轉(zhuǎn)錄因子3、4；ki-67

皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌是最常見的兩種皮膚腫瘤，二者鑒別診斷主要依靠病理組織學(xué)。除此之外，臨床最常用的輔助診斷方法通常選擇免疫組化染色。而現(xiàn)有的常用蛋白標(biāo)志物不足以起到有效的鑒別診斷作用。因此，尤其在病理診斷有困難的情況下，需要可靠的蛋白標(biāo)志物來幫助正確區(qū)分這兩類皮膚腫瘤，提高診斷水平。

活化轉(zhuǎn)錄因子3、4（activating transcriptionfactor 3、4，ATF3、4）是活化轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在正常組織中表達(dá)較少，在一些腫瘤組織細(xì)胞中高表達(dá)。但在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)、意義報(bào)道較少，作用機(jī)制不甚明確。Ki-67是臨床上檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用指標(biāo)之一。本文采用免疫組化染色的方法研究ATF3、4和ki-67皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義。

1　材料和方法

1.1病例資料

從筆者所在醫(yī)院院病理科儲(chǔ)存的蠟塊庫中選擇皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)為病理診斷為皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌的患者，無年齡、性別、種族、病損部位限制。排除標(biāo)準(zhǔn)：同一疾病復(fù)發(fā)再次手術(shù)患者；器官移植后發(fā)生皮膚腫瘤患者。通過調(diào)閱病案資料發(fā)現(xiàn)，2008年1月-2014年2月，筆者所在醫(yī)院住院患者中（整形科、皮膚科）符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)、確診為皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌各有658和877人次。其中皮膚鱗癌根據(jù)鱗狀細(xì)胞分化程度分為高、中、低分化皮膚鱗癌。根據(jù)住院號(hào)按順序編號(hào)，利用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)選擇皮膚鱗癌96例、基底細(xì)胞癌118例。兩組患者年齡、性別、病損部位無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2主要試劑

兔抗人ATF3、4、ki-67抗體（美國Abcam公司，編號(hào)分別為ab176872，ab31390，ab66155）、SP試劑盒（含二抗、DAB顯色劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3免疫組化染色

石蠟包埋組織4μm連續(xù)切片，常規(guī)37℃烘烤30min，后二甲苯、乙醇脫蠟、水化，3%過氧化氫溶液浸泡10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。ATF3、4采用高溫抗原、EDTA修復(fù)20 min，緩慢復(fù)溫至室溫水洗后PBS清洗3次，每次3 min，正常血清封閉15 min后加一抗（ATF3濃度為1：200；ATF4濃度為1：150；ki-67濃度為1：100），4℃過夜，PBS清洗3次，每次3 min。加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育15 min，PBS洗滌3次，每次3 min；加DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)

ATF3定位于胞核和（或核仁），ATF4定位于胞漿，陽性染色均為棕黃至棕褐色顆粒。每張切片在×400高倍視野下隨機(jī)選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。采用陽性細(xì)胞比例和著色強(qiáng)度兩項(xiàng)綜合評(píng)定陽性結(jié)果，（0～+）不著色或淡黃色或陽性細(xì)胞數(shù)＜10%；++黃色或陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%；+++棕黃色或陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。Ki-67抗原的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，陽性染色均為棕黃至棕褐色顆粒。不著色或陽性細(xì)胞數(shù)＜10%者為-，淡黃色或陽性細(xì)胞數(shù)10%～24%為+，黃色或陽性細(xì)胞數(shù)25%～49%者為++，棕黃色或陽性細(xì)胞數(shù)≥50%者為+++。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。對(duì)于ATF3、4和ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)差別，運(yùn)用Mann-Whitney Test進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。ATF3、4表達(dá)強(qiáng)度與皮膚鱗癌分化程度相關(guān)性，用Spearman秩相關(guān)系數(shù)描述并進(jìn)行t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為0.05（雙側(cè)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　ATF3、ATF4和ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

2　結(jié)果

2.1陽性表達(dá)結(jié)果

ATF3、ki-67陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和（或）核仁，ATF4陽性表達(dá)定位于胞漿，均呈淡黃色至棕黃色（圖1）。

2.2結(jié)果統(tǒng)計(jì)

皮膚鱗癌中ATF3著色細(xì)胞＞10%占78%，相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度在++及以上占53%?；准?xì)胞癌中ATF3的表達(dá)情況與此迥然不同，ATF3著色細(xì)胞＞10%占61%（其中25%由向鱗狀細(xì)胞分化型構(gòu)成），相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度在++及以上占62%左右（其中27%由向鱗狀細(xì)胞分化型構(gòu)成）。ATF3在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（z=-3.014，P=0.003和z=-2.099，P=0.036）。類似的結(jié)果在ATF4中也可見到（z=-3.197，P=0.001和z=-2.276，P=0.023）。且ATF3、4的表達(dá)強(qiáng)度和皮膚鱗癌分化程度成正相關(guān)，即分化程度低越低，表達(dá)強(qiáng)度越高，r=0.395，P=0.000和r=0.303，P=0.001，（表2、3）。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，z=-0.362，P= 0.718和z=-0.184，P=0.0.854，（圖2～4）。

表1　所納入病例的基本情況

表2　ATF3表達(dá)強(qiáng)度與皮膚鱗癌分化程度的關(guān)系

表3　ATF4表達(dá)強(qiáng)度與皮膚鱗癌分化程度的關(guān)系

圖2　ATF3在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)

圖3　ATF4在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)

圖4　ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)

3　討論

ATF3、4是ATF/CREB亞家族的成員之一，在正常組織中較少表達(dá)，而在細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激事件時(shí)較高表達(dá)。ATF3、4是應(yīng)激早期快速反應(yīng)基因，在一系列損傷性應(yīng)激信號(hào)如：缺氧、DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等情況下，ATF3、4基因在體內(nèi)外會(huì)被快速誘導(dǎo)表達(dá)［1-4］。有許多研究顯示，ATF3、4在多種腫瘤中被檢測(cè)到異常表達(dá)，并且與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但其確切的機(jī)制尚不甚明了。

筆者納入的病例中，60%～70%以上的病損位于頭面頸部（表1）。基底細(xì)胞癌的發(fā)病與紫外線輻射有關(guān)，但它起源于毛囊干細(xì)胞，發(fā)病與皮脂腺關(guān)系更密切，故基底細(xì)胞更常見于頭面部（約80%）等皮脂腺豐富的部位。鱗狀細(xì)胞發(fā)病除與紫外線輻射有關(guān)外，還與各種長(zhǎng)期的不良刺激有關(guān)確（如溫?zé)?、化學(xué)刺激、HPV感染等等），一般鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生于有皮膚病變的基礎(chǔ)上，所以鱗狀細(xì)胞癌頭面部發(fā)生與下肢發(fā)生的比例大致相當(dāng)。最近的研究提示，紫外線A致癌可能與其能活化核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）有關(guān)，NRF2能直接結(jié)合于ATF3啟動(dòng)子從而增強(qiáng)其表達(dá)［5］。

有研究發(fā)現(xiàn)，基底上皮細(xì)胞過度表達(dá)ATF3的轉(zhuǎn)基因小鼠，會(huì)出現(xiàn)表皮增生，并且會(huì)有患口腔癌、基底細(xì)胞瘤和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［6］。但在筆者的研究中，基底細(xì)胞癌陽性表達(dá)ATF3較皮膚鱗癌明顯偏低。與本研究結(jié)果類似，Rose等通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ATF3在皮膚鱗癌中的表達(dá)較基底細(xì)胞癌、脂溢性角化病、結(jié)節(jié)性癢疹高，故ATF3可用做區(qū)分皮膚鱗癌和其他皮膚增生性疾?。?］。然而，ATF3、4在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)差異，提示二者發(fā)病機(jī)制中的某些分子事件可能不完全相同，目前尚無相關(guān)基礎(chǔ)研究的證據(jù)報(bào)道。

ATF3、4有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移作用。ATF3在皮膚轉(zhuǎn)移性鱗癌中高表達(dá)提示它可能與腫瘤的惡性生物學(xué)行為有關(guān)［8］。在前列腺癌中也證實(shí)了腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Drg-1是通過下調(diào)ATF3的表達(dá)發(fā)揮作用的［9］。雖然ATF3促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制不甚清楚，但是其表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活力和侵襲力。筆者觀察到，在多數(shù)表達(dá)ATF3、4活性的基底細(xì)胞癌病例中，同時(shí)表現(xiàn)出鱗狀細(xì)胞分化特點(diǎn)，這個(gè)特點(diǎn)被認(rèn)為與基底細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移行為相關(guān)［10-11］。然而，由于轉(zhuǎn)移性皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌相對(duì)少見，無隨訪資料，筆者缺乏相關(guān)支持這種觀點(diǎn)的證據(jù)。在筆者的研究中，所有具有ATF3、4活性的病例沒有表現(xiàn)出侵襲性生物學(xué)行為。

ATF3、4在皮膚鱗癌中同時(shí)升高，且二者的表達(dá)強(qiáng)度和分化程度成正相關(guān)，即分化越低，表達(dá)越高，其機(jī)制可能與ATF4-ATF3-p53這一級(jí)聯(lián)模式有關(guān)。ATF4也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)ATF3生成過程中所必需的因子［12］，另一研究發(fā)現(xiàn)缺氧可以不依賴HIF的方式誘導(dǎo)ATF3的生成［13］。ATF3是一個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，它可能參與到ATF4對(duì)于下游靶點(diǎn)的作用中。近年來有研究報(bào)道p53可參與線粒體呼吸的調(diào)節(jié)作用［14］。ATF3可增加p53穩(wěn)定性，同時(shí)也能抑制p53的功能。最近的研究也持類似的觀點(diǎn)，認(rèn)為ATF3能通過抑制P53表達(dá)后激活Stat3磷酸化促進(jìn)皮膚癌增殖從而促進(jìn)癌癥發(fā)生［15］。

Ki-67是近年臨床上常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖的指標(biāo)之一。無論正常細(xì)胞株或腫瘤細(xì)胞株，其抗原性的表達(dá)隨細(xì)胞周期的進(jìn)展而增加，它在G0期和G1早期不表達(dá)，G1中期到后期始出現(xiàn)表達(dá)，S期到后半期增加明顯，G2/M期達(dá)高峰，其在細(xì)胞分裂后迅速降解或丟失，它的表達(dá)是細(xì)胞處于分裂期的標(biāo)志，其表達(dá)高低反映細(xì)胞增殖的程度可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞增殖的情況。筆者發(fā)現(xiàn)ki-67在皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌中的表達(dá)無明顯差異，但其具體機(jī)制不明。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地支持筆者的假設(shè)：ATF3、4可以作為鑒別皮膚鱗癌和基底細(xì)胞癌的新的蛋白標(biāo)記物和皮膚鱗癌惡性程度及預(yù)后的判斷指標(biāo)。而體外及動(dòng)物模型的相關(guān)研究，可為筆者進(jìn)一步揭示其在皮膚鱗癌中表達(dá)的意義提供參考

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編輯/張惠娟

The expression meaning of activating transcription factor 3，activating transcription factor 4 and ki-67 in skin squamous cell carcinoma

LI Chun，ZHOU Wei-jun，SONG Zhao-hui，LI Zhao-yang，YU Ping，ZENG Xue-wen，GUO Zhi-long
（Department of Plastic Surgery，Xinjiang Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

ObjectiveTo discuss the expression of activating transcription factor 3，activating transcription factor 4（ATF3，4）and ki-67 in skin squamous carcinomas and basal cell carcinomas and their clinical significances.Methods Using immunohistochemical method to detect ATF3，4 and ki-67 expression in 96 cases of skin squamous carcinoma and 118 cases of basal cell carcinoma tissues，which were randomly selected from the hospital preserved in pathology department，then analysis the meaning of expression.Results ATF3，4 in skin squamous carcinomas is higher than that in basal cell carcinomas，the differences were statistically significant（P=0.003 and 0.001，respectively），but there was no difference for ki-67（P=0.718）.Positive correlation could be found between ATF3，4 expression strength and skin squamous cell carcinoma differentiation（r=0.395，P=0.000；r=0.303，P= 0.001，respectively）.Conclusion ATF3，4 may be used as the reliable differential protein markers between skin squamous cell carcinoma and basal cell carcinoma，and they be seen as malignant degree and prognosis indexes of cutaneous squamous cell.

squamous cell carcinoma；basal cell carcinoma；immunohistochemical method；activating transcription factor 3，4；ki-67

R730.261

A

1008-6455（2015）12-0040-04

新疆自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)項(xiàng)目：活化轉(zhuǎn)錄因子3、4和ki-67在皮膚鱗癌中的表達(dá)意義（編號(hào)：20130233）

郭智龍，主任醫(yī)師，科主任，整形外科專業(yè)；新疆烏魯木齊市新疆自治區(qū)人民醫(yī)院整形外科，郵編：830000

2015-04-11

2015-06-09