管祖東　呂小玲　李文跡　羅忠寶

（福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司　福建光澤　354100）

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法在檢測雞肉和雞蛋中氯霉素殘留的應(yīng)用

管祖東呂小玲李文跡羅忠寶

（福建圣農(nóng)發(fā)展股份有限公司福建光澤354100）

建立了雞肉、雞肝和雞蛋中氯霉素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，試樣經(jīng)三氯乙酸除蛋白及乙酸乙酯液液萃取提取和凈化后，C18柱HPLC進(jìn)行分離，多反應(yīng)選擇離子檢測。方法的回收率和變異系數(shù)分別在80%～110%和8%～10%。該方法對雞肉中氯霉素檢測限為0.1μg/kg。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜氯霉素殘留雞肉雞蛋

氯霉素是第一個(gè)可人工合成的抗生素，主要用于腸道感染，同時(shí)亦可用于子宮炎、乳腺炎等局部感染。但由于其在動物體內(nèi)產(chǎn)生殘留，主要會抑制骨髓造血機(jī)能，對人體危害較大［1］，歐盟很早就禁止其應(yīng)用于可食性動物的飼養(yǎng)過程［2］，我國也出臺相應(yīng)的政策、法規(guī)及測定標(biāo)準(zhǔn)，禁止其用于食用動物［3］。國內(nèi)外關(guān)于氯霉素的殘留分析方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）［4］、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）［5-6］。其中HPLC檢測靈敏度低；GC-MS需進(jìn)行衍生化樣品，前處理繁瑣；HPLC-MS在氯霉素殘留檢測中發(fā)揮著重要作用，但肝臟及雞蛋中殘留檢測分析有待完善。本研究建立了雞肉、雞肝和雞蛋中氯霉素的檢測方法，該方法準(zhǔn)確、靈敏度高，適合雞肉、雞肝和雞蛋中氯霉素的快速確證分析。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑氯霉素，含量99.0%，德國Dr. Ehrenstorfera公司；乙酸銨、甲酸、乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純。

1.2儀器與設(shè)備Agilent 6460液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；吹氮濃縮裝置，北京八方；IKA MS 3 basic微型混合器；水浴恒溫振蕩器等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.3樣品前處理

1.3.1氯霉素提取

1.3.1.1雞肉和雞肝的前處理稱取經(jīng)肉類組織粉碎的試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入氯霉素-D5工作液（50 ng/mL）100μL，再加入乙酸乙酯約15 mL，震蕩提取0.5 min，以4 000 r/min離心5min。上清液經(jīng)過一裝有約10 g無水硫酸鈉的漏斗，收集乙酸乙酯提取液于250 mL棕色雞心瓶中。殘?jiān)?0mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次提取液乙酸乙酯。

1.3.1.2雞蛋的前處理稱取經(jīng)肉類組織粉碎的雞蛋樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入氯霉素-D5工作液（50 ng/mL）100μL，再加3 g/L三氯乙酸2 mL，加入乙酸乙酯約15 mL，震蕩提取0.5min，以4 000 r/min離心5min。上清液經(jīng)過一裝有約10 g無水硫酸鈉的漏斗，收集乙酸乙酯提取液于250mL棕色雞心瓶中。殘?jiān)?0mL乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并2次提取液乙酸乙酯。

1.3.2凈化方法將雞心瓶中乙酸乙酯置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在40℃水浴中減壓蒸發(fā)至干。加入2 mL5%乙腈-水溶液溶解殘留物，將溶解液移入15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，漩渦震蕩0.5min，以4 000 r/min離心5min。棄去正己烷層，重復(fù)1次。5%乙腈-水層過艾杰爾PEP萃取柱。（1）加入5 mL甲醇活化，然后用5 mL水平衡；（2）上樣；（3）用5mL 5%甲醇淋洗；（4）5mL乙腈洗脫。將洗脫液置于氮?dú)饬飨麓抵两桑?%乙腈-水定容至1mL，過0.22μm微孔濾膜，置2mL樣品瓶。

1.4測定

1.4.1色譜條件a）色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，3.5μm×100 mm×2.1 mm（id）；b）流動相：乙腈+0.005mol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫模式。梯度表分別見表1。c）柱溫：25℃；d）進(jìn)樣量：10μL。e）接口及離子化方式：ESI+AJS，正離子檢測。干燥氣6 L/min，干燥溫度350℃，鞘氣10 L/min，鞘氣溫度250℃，氣體均為氮?dú)猓浑婋x電壓：3 500 V，各離子對的去簇電壓、碰撞能CE見表2。

表1　流動相梯度表

1.4.2質(zhì)譜條件見表2。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化將1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液用蠕動泵以5μL/min的流速連續(xù)注射入質(zhì)譜儀，在負(fù)離子模式下先進(jìn)行一級質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到準(zhǔn)分子離子峰（M-1）即m/z321，優(yōu)化去簇電壓。對m/z 321進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，優(yōu)化碰撞電壓，然后對離子源溫度、干燥氣、輔助鞘氣等進(jìn)行優(yōu)化。再以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負(fù)離子模式優(yōu)化去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)。分別選擇豐度較強(qiáng)的2個(gè)子離子為定量及定性離子，以母離子與子離子組成監(jiān)測離子對，進(jìn)行定性和定量分析。

表2　質(zhì)譜參數(shù)

2.2樣品前處理?xiàng)l件的選擇液液萃取是一種比較經(jīng)典的凈化方法，它是利用待測組分與樣品雜質(zhì)在兩相中的溶解性差異來凈化樣品的。樣品提取過程中不可避免的會攜帶許多與待測組分溶解性相似的雜質(zhì)一并轉(zhuǎn)移出來，這些微量的雜質(zhì)會干擾光譜檢測、增加基線噪聲、降低柱效、堵塞色譜管路、污染色譜柱和檢測器。根據(jù)藥物的理化性質(zhì)，通過液液萃取將待測組分與雜質(zhì)進(jìn)行分離，通過這樣的一些過程使樣品達(dá)到凈化的效果，便于檢測。本研究雞肉中氯霉素的殘留用乙酸乙酯作為提取劑，雞蛋中含蛋白質(zhì)和脂肪較高，對檢測的干擾大，先加入三氯乙酸沉淀蛋白，減少提取過程中的干擾，本研究比較了乙酸乙酯和乙腈的提取。結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取基質(zhì)干擾少、回收率高、前處理相對簡單。

2.3方法的定量限、回收率、重復(fù)性及線性范圍在以上確定的測定條件下，配制標(biāo)準(zhǔn)系列（n=6），分析化合物的濃度比為X軸，以分析物的峰面積比為Y軸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，氯霉素濃度在0.1～20 μg/L時(shí)，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)和回歸方程為Y=1.298125*X-0.004766，r2=0.9995。在空白樣品中添加氯霉素和氯霉素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3個(gè)水平濃度的添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)。見表3。

表3　樣品添加回收率及精密度測試結(jié)果（n=6）

圖1　空白雞肉樣品離子圖譜

圖2　添加0.1μg/kg氯霉素樣品離子色譜圖

3　結(jié)　論

雞肉中的氯霉素殘留可利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行快速測定，該方法非常適合雞肉中氯霉素的快速定量定性分析，在0.1～20μg/kg添加水平范圍內(nèi)的平均回收率為88.4%～106.2%，相對偏差為9.0%～10.1%，方法檢測限等指標(biāo)滿足國內(nèi)外檢測的相關(guān)要求。

［1］Comm ission Regulation（EC）No.2788/98.O ff J Eur Commun，1998-12-23（L347/31）.

［2］Food and Agriculture O rganization of the United Nations（FAO）and W orld Health O rganization（WHO）.Joint FAO/ WHOExpert Committee on Food Additives Sixtieth Meeting，Geneva：FAO/WHO，2003.

［3］農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號［EB/OL］. （2002-12-24）.http：//yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

［4］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［5］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 20756-2006可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［6］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1864-2007進(jìn)出口動物源性食品中氯霉素殘留量的檢測方法：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

Determ ination of the residues of chloram phenicols in chicken and eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Guan Zudong Lv Xiaoling LiWenji Luo Zhongbao
（Fujian sunner development CO.，LTD.，Guangze 354100）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the quantitative determination of chloramphenicols respectively in the chicken and liver of chicken and eggs.The chloramphenicols in eggs were deproteinated with acetocaustin acid and acetic ether followed by liquid-liquid extraction.Further clean-up was performed by solid phase extraction（SPE）throughmixed mode columns（PEPSPE）.The separation of the compoundswas carried on a Agilent Eclipse Plus C18 column（C18，3.5μm×100 mm×2.1 mm（id）by a gradient elution using acetonitrile and 0.1%formic acid asmobile phases. The analyteswere detected by tandem mass spectrometry inmultiple reactionmonitoring（MRM）modewith negative electrospray ionization．The chloramphenicols quantified by internal standard method．The linear rangeswere 0.1～20.0μg/L and the correlation coefficientswere not less than 0.9995.The average recoveries and relative standard deviations ranged from80%-110%and 8%～10%respectively at the spiked levels of 0.1，0.2 and 1.0μg/kg for the bothmarkers.The limit of quantitation（LOQ）was 0.1μg/kg.Themethod is sensitive，accurate and suitable for the determination and confirmation of chloramphenicols in chicken and eggs.

HPLC-MS/MS chloramphenicols residue chicken eggs

A

1003-4331（2015）02-0028-03

福建省區(qū)域科技重大項(xiàng)目（2012N 3011）“規(guī)?；子鹑怆u肉品生產(chǎn)獸藥殘留監(jiān)控技術(shù)的研究與應(yīng)用”資助。