衛(wèi)玲趙瑩 徐曉晶*

（上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心 上海 201203）

碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在畢赤酵母中的異源表達(dá)*

衛(wèi)玲**趙瑩 徐曉晶***

（上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心 上海 201203）

碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydrase Ⅱ, CA Ⅱ）是參與機(jī)體多種代謝活動(dòng)和病理活動(dòng)的一種重要催化酶。通過(guò)基因重組、電轉(zhuǎn)化等方式，得到能異源高表達(dá)人CA Ⅱ的畢赤酵母（Pichia. pastoris）GS115工程菌。對(duì)工程菌進(jìn)行培養(yǎng)及甲醇誘導(dǎo)后，經(jīng)離子交換層析柱分離純化后得到較純的重組CA Ⅱ。通過(guò)Western blotting、酶活力及圓二色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組和商品化CA Ⅱ具有相似的酶活力和構(gòu)象，為CA Ⅱ今后進(jìn)一步在臨床的研究和工業(yè)應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

碳酸酐酶Ⅱ 畢赤氏酵母 異源表達(dá) 甲醇誘導(dǎo)

碳酸酐酶（carbonic anhydrases, CAs，EC 4.2.1.1）是一類含鋅金屬酶[1]，由Meldrum和Roughton于1933年首次從紅細(xì)胞中分離純化得到[2]，現(xiàn)已證實(shí)其廣泛存在于生物體內(nèi)，包括動(dòng)物、植物、水藻、細(xì)菌以及古細(xì)菌。根據(jù)其氨基酸序列的不同，碳酸酐酶至少有α、β、γ、δ、ε、ζ等六種不同類型[3-4]。多年來(lái)人們對(duì)碳酸酐酶的研究主要集中在與人類關(guān)系密切的α-CAs和β-CAs上[2]。人體中的α-CAs至少存在14種同工酶（HCA I-XIV），因CA Ⅱ在紅血球中的大量分布，使其成為研究最廣泛的同工酶[5-6]。CA Ⅱ分子量約為30 kDa，它的活性中心主要由兩部分組成：一是在配基His-94，His-96，His-119，Thr-199，Glu-106，His-64參與下Zn2+與H2O或OH-形成的多面體；二是在上述多面體的臨近處有一個(gè)由Leu-198，Val-143，Val-121，Trp-209組成的結(jié)合有CO2的疏水袋。

由于該酶在體內(nèi)分布廣泛，雖然其催化的只是一個(gè)簡(jiǎn)單的生理反應(yīng)，但是其催化的底物CO2及產(chǎn)物HCO3-、H+卻與人體多種生理及病理活動(dòng)關(guān)系密切，如呼吸過(guò)程中代謝組織與肺之間CO2/HCO3-的轉(zhuǎn)運(yùn)，pH與CO2濃度之間的平衡，組織器官中電解質(zhì)的分泌，青光眼、骨質(zhì)疏松癥、癲癇、腫瘤等疾病的形成等。若該酶表達(dá)異常或活性發(fā)生改變都會(huì)引起機(jī)體的病變，糾正該酶異常表達(dá)或抑制該酶的過(guò)高活性也能對(duì)CA Ⅱ引發(fā)的疾病起到積極的治療作用[7]。例如，CA Ⅱ抑制劑能有效降低眼內(nèi)壓，減少HCO3-的生成，進(jìn)而減少房水的生成，可用于治療青光眼[8-9]。另外，該酶也與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)，由于CA Ⅱ的表達(dá)隨著破骨細(xì)胞功能狀態(tài)的不同而發(fā)生變化，在骨吸收狀態(tài)下它呈高表達(dá)，所以抑制該酶活性可以降低破骨細(xì)胞的骨吸收作用，改善骨吸收的酸性微環(huán)境，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的目的。這使得CA Ⅱ成為多種人類疾病研究中的重要靶點(diǎn)，對(duì)該酶的研究也逐漸成為熱點(diǎn)[10-12]。

1 材料

分泌型表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，Pichia pastoris GS115均由復(fù)旦大學(xué)宋大新老師惠贈(zèng)。限制內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司；蛋白胨、酵母提取物等培養(yǎng)基均購(gòu)自上海生工公司，抗CA單克隆抗體（一抗）購(gòu)自Medix，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體（二抗）購(gòu)自晶美公司，引物均由上海生工公司合成； 商品化CAⅡ?qū)φ召?gòu)自USCN公司。

2 方法

2.1 caⅡ基因的克隆、表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115

以人胎盤(pán)組織提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法合成cDNA；設(shè)計(jì)引物5’-Primer：(GACCCAAT)CTCGAGGCAGTGGTCAAAGTGCCCCTG（下劃線為Xho I 位點(diǎn)），3’-Primer：(GT)GCGGCCGCTTA GGCGGCAGTGGCAAAGC（下劃線為Not I位點(diǎn)），再以cDNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增獲編碼CA Ⅱ的基因片段（PCR條件： 95 ℃，5 min； 94 ℃變性30 s； 54 ℃退火30 s； 72 ℃延伸40 s；循環(huán)32 次； 最終70 ℃ 10 min，于16℃保存），擴(kuò)增的caⅡ基因片段經(jīng)Xho I和Not I雙酶切克隆至P. pastoris的分泌型表達(dá)載體pPIC9k，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-CAⅡ（圖1）。

所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k-CAⅡ用Bgl II酶切線性化，電轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115（His mut+）的感受態(tài)細(xì)胞，取200 ml涂布MD平板，于30℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，得到1 000余個(gè)轉(zhuǎn)化子[13]。

2.2 篩選高表達(dá)CA Ⅱ的畢赤酵母重組菌株

將上述1 000余個(gè)轉(zhuǎn)化子依次點(diǎn)種到含G418分別為1、2、3和4 mg/L的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)，在含4 mg/L的G418平板上獲得35個(gè)G418抗性轉(zhuǎn)化子。

從上述35個(gè)G418抗性轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)選擇22個(gè)單菌落分別接入含3 ml BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；每份菌液各吸取1.5 ml接入含40 ml BMGY的培養(yǎng)基，同樣條件下培養(yǎng)24 h，于室溫離心 1 500 g，6 min，收集菌體。將菌體重懸于15 ml BMMY培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)24 h，加入培養(yǎng)基體積1%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別在誘導(dǎo)12、24和36 h時(shí)取樣做SDS-PAGE電泳，篩選獲得7株具有約30 kDa蛋白條帶的高表達(dá)工程菌株[14]。

圖1 重組pPIC9k-CAⅡ質(zhì)粒的構(gòu)建

2.3 重組CA Ⅱ在畢赤酵母中的異源高表達(dá)

從YPD斜面培養(yǎng)基挑選單菌落，接入含40 ml BMGY的250 ml 搖瓶，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。收集菌體用200 ml BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基懸浮，同樣條件下培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)24 h時(shí)補(bǔ)一次甲醇，體積為培養(yǎng)基體積的1%。

2.4 重組CA Ⅱ的Western-blot鑒定

將電泳后的SDS-PAGE凝膠剝離，按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移[15]、脫脂牛奶封閉、一抗及二抗孵育，然后顯色、漂洗并終止顯色，觀察Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5 重組CA Ⅱ的分離純化

發(fā)酵上清液邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至飽和度為60%，冰浴攪拌2 h后1 500 g離心，棄上清，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5緩沖液復(fù)溶。復(fù)溶液用截留分子量為10 kD的透析袋對(duì)50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5透析過(guò)夜，然后，進(jìn)行離子交換層析（Q-Sepharose Fast Flow，CV=1 ml，流速：1mL/min）。離子交換洗脫液A1 為50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，B1為1 mol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，分3段梯度洗脫，梯度分別為：35%B1、60%B1、100%B1，每段洗脫體積為10×CV、時(shí)間10 min。

2.6 重組CA Ⅱ酶活力測(cè)定

碳酸酐酶活力的測(cè)定參照Brownell等[16]方法略作改進(jìn)：在一個(gè)4 ℃的冷凍反應(yīng)室中, 加入5 ml巴比妥-KOH緩沖液（20 mmol/L, pH 8.3），并加入0.5 ml煮沸或未煮沸的CA Ⅱ，再注入4.5 ml 冰冷的CO2飽和水，測(cè)定pH下降的速度差異。酶活單位數(shù)(U)由公式10(T0/Te-1)求得，T0和Te 分別為加入煮沸和未煮沸CA Ⅱ測(cè)得的pH下降1所需時(shí)間。酶活力以每mg 蛋白含有的酶活單位數(shù)（U/ mg）表示[17]。以購(gòu)買的商品化CA Ⅱ?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)參照（酶活力約為209 U/ml）。

2.7 酶穩(wěn)定性研究

2.7.1 不同pH對(duì)酶穩(wěn)定性影響

重組與商品化CA Ⅱ（濃度均為0.02 nmol/L）在pH 為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0時(shí)分別放置10 min，測(cè)定酶活力。

2.7.2 不同溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性影響

重組與商品化CA Ⅱ（濃度均為0.02 nmol/L）在25～65 ℃范圍，每隔5 ℃放置10 min，測(cè)定酶活力。

2.8 圓二色性比較

重組與商品化CA Ⅱ濃度都為1.0 mg/ml，上海藥物所J-810圓二色光譜儀（日本分光 JASCO）在190～320 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)，研究?jī)烧邩?gòu)象的相似程度。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR擴(kuò)增重組caⅡ基因

按照2.1方法擴(kuò)增了重組caⅡ基因，得到大小為800 bp的片段。電泳檢測(cè)見(jiàn)圖2。

3.2 caⅡ的基因克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2 擴(kuò)增caⅡ基因的電泳圖

將克隆得到的caⅡ基因測(cè)序，并與GenBank中的人ca Ⅱ基因cDNA序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明我們獲得的caⅡ（NM000067）基因序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的人ca Ⅱ基因序列100%匹配。得到的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-CAⅡ，導(dǎo)入P. pastoris GS115后進(jìn)行篩選，經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子插入片段大小正確（圖3）。

圖3 編碼人caⅡ基因的PCR擴(kuò)增電泳圖

3.3 表達(dá)條件試驗(yàn)

從圖4可以看出，隨著發(fā)酵誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯升高。通過(guò)SDS-PAGE電泳圖譜判斷，加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)24 h時(shí)蛋白條帶最深，表明其蛋白表達(dá)量最高。故確定CAⅡ在BMMY培養(yǎng)基中的最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為24 h。

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)的CA Ⅱ的SDS-PAGE電泳

3.4 Western blotting鑒定

SDS-PAGE電泳圖譜表明：重組CA Ⅱ的分子質(zhì)量與對(duì)照商品化CA Ⅱ一樣，約30 kDa。Western blotting結(jié)果表明在與SDS-PAGE電泳的特異蛋白條帶相應(yīng)位置出現(xiàn)一條特異的雜交帶（圖5）。

圖5 SDS-PAGE（左）及Western blotting（右）圖譜

3.5 重組CA Ⅱ的分離純化

經(jīng)QFF離子交換柱純化，收集的第8管到第15管樣品含有較純的重組CA Ⅱ。測(cè)定合并后的CA Ⅱ的比活力為188 U/mg。

圖6 重組CA Ⅱ純化圖譜

圖7 純化CA Ⅱ的SDS-PAGE電泳圖

3.6 重組CA Ⅱ的穩(wěn)定性

3.6.1 不同pH對(duì)酶活力的影響

pH對(duì)兩種CA Ⅱ酶活力影響的試驗(yàn)表明，pH對(duì)兩者的酶活力影響基本一致，pH為7.0時(shí)活性最高（記為100%），pH為1.0時(shí)酶活力最低（圖8）。

圖8 不同pH對(duì)酶活力的影響

3.6.2 不同溫度對(duì)酶活力影響

在溫度為35～45 ℃時(shí)酶活力最高（記為100%），然后呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為65 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到我們?cè)囼?yàn)的最低點(diǎn)（圖9）。

圖9 不同溫度對(duì)酶活力的影響

3.7 圓二色性比較結(jié)果

圓二色性比較結(jié)果顯示重組和商品化CA Ⅱ的構(gòu)象基本一致(圖10)。

圖10 圓二色性比較

4 討論

本研究構(gòu)建了重組CA Ⅱ的Pichia. Pastoris異源表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)人重組CA Ⅱ，分離純化后得到較純的重組蛋白。經(jīng)酶活力檢測(cè)及圓二色譜分析等發(fā)現(xiàn)該重組蛋白與商品化CA Ⅱ具有相似的酶活力及構(gòu)象。該酶在35～45 ℃時(shí)活性最高，隨著溫度的上升，其活性急劇下降。由于該酶在堿性條件下出現(xiàn)了沉淀，故未做堿性條件下的酶活力試驗(yàn)。

本研究克隆的重組CA Ⅱ有助于其在畢赤酵母中的發(fā)酵生產(chǎn)及大量制備，將來(lái)可作為抗原蛋白開(kāi)發(fā)青光眼、骨質(zhì)疏松等疾病的診斷試劑，也可以作為藥物靶點(diǎn)蛋白研發(fā)針對(duì)這些疾病治療的抑制劑，為其進(jìn)一步在醫(yī)藥開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[18]。

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Cloning of a gene encoding carbonic anhydrase Ⅱand heterologous expression in Pichia pastoris*

WEI Ling**, ZHAO Ying, XU Xiaojing***
(Shanghai Biochip Co. Ltd./ National Engineering Center for Biochip at Shanghai, Shanghai 201203, China)

Carbonic anhydraseⅡ(CAⅡ) is an important enzyme involving in various metabolic activities and pathological activity. A gene coding for carbonic anhydraseⅡwas cloned from human placenta and an expression plasmid was constructed with plasmid pPIC9K and introduced into a strain of Pichia. pastoris GS115 by electro-transformation to obtain an engineered strain. The recombinant CAⅡwas heterologously overexpressed in the engineered strain GS115 by induction with methanol and purified by anion-exchange chromatography. The purified recombinant CAⅡwas verified to have very similar characteristics to a commercial CAⅡthrough Western blotting，enzyme activity analysis and circular dichroism spectra. This work can lay a foundation for the clinical research and industrial application of CAⅡ in the future.

carbonic anhydraseⅡ; Pichia. pastoris; heterologous expression; methanol induction

Q78

A

1006-1533(2015)17-0074-05

國(guó)家863項(xiàng)目（2006AA02A252）；上海市科委創(chuàng)投聯(lián)動(dòng)計(jì)劃 （13CT1900900）

**

衛(wèi)玲（1977-），女，碩士，工程師，從事蛋白質(zhì)表達(dá)及分離純化研究。E-mail: sophyling@ mail.sh.cn

***

徐曉晶，博士，副研究員。E-mail: xiaojing_xu@shbiochip.com

2015-05-29）