聶　芳　趙賢元　余躍天　殷　榮　李昱潔　曹建國　皋　源

PPARα/COX-2/PGE2通路在人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞中的作用研究

聶芳趙賢元余躍天殷榮李昱潔曹建國皋源

目的初步檢測(cè)PPARα對(duì)COX-2蛋白表達(dá)和酶活性的影響，推測(cè)PPARα/COX-2/PGE2通路在人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞中的可能作用。方法Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)SW1116細(xì)胞、SW1116/HCPT細(xì)胞，以及下調(diào)PPARα表達(dá)后SW1116細(xì)胞中COX-2的表達(dá)差異；ELISA檢測(cè)WY-14643分別干預(yù)SW1116細(xì)胞，SW1116/HCPT細(xì)胞，以及下調(diào)PPARα表達(dá)后各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度PGE2對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果COX-2在耐藥細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。PPARα表達(dá)下調(diào)抑制COX-2表達(dá)。PPARα激動(dòng)劑WY-14643促進(jìn)細(xì)胞釋放PGE2［250 μM：（0.7851± 0.0203）ng/mL vs（0.2443±0.01228）ng/mL，P=0.000；100 μM：（0.5483±0.0614）ng/mL vs（0.2443± 0.01228）ng/mL，P=0.0083］；PGE2降低細(xì)胞周期G1期比例，升高S期比例，PI由對(duì)照組的（32.2± 2.13）%，上升到（42.2±3.14）%、（52.1±2.43）%，P=0.0123。結(jié)論人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞中COX-2表達(dá)顯著下調(diào)；PPARα有促進(jìn)COX-2蛋白表達(dá)和酶活性的作用。

結(jié)直腸癌；環(huán)氧合酶2；耐藥；PGE2；PPARα

【Abstract】Objective To explore the regulation of PPARα to COX-2 protein expression and COX-2 enzyme activity，and to find out the role of PPARα/COX-2/PGE2pathway in drug resistance colorectal cancer cells.Methods The expressions of COX-2 were measured by Realtime PCR and Western blot in SW1116 cells，SW1116/HCPT cells and SW1116 cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα；PGE2concentration in culture supernatants was detected by ELISA in SW1116 cells and SW1116/HCPT cells treated with PPARα agonist WY-14643，SW1116 cells and SW1116/HCPT cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα；cell cycles of SW1116/HCPT cells treated with PGE2were assessed by flow cytometry.Results Protein and mRNA expressions of COX-2 were much lower in SW1116/HCPT cells and SW1116 cells transfected with siRNA vectors for silencing PPARα than in SW1116 cells.PGE2concentrations in cells culture supernatants of SW1116/HCPT cells were elevated after treatment with WY-14643［100 μM：（0.5483± 0.0614）ng/mL；250 μM：（0.7851±0.0203）ng/mL］；proliferation index were elevated in SW1116/HCPT cells with PGE2［10-8mol/L：（42.2±3.14）；10-7mol/L：（52.1±2.43）%；con：（32.2±2.13）%］.Conclusions The expression of COX-2 were much lower in SW1116/HCPT cells than in SW1116 cells.PPARα promoted the protein expression and enzyme activity of COX-2.

【Key words】Colorectal Cancer；COX-2；Drug Resistance；PGE2；PPARα

環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）作為前列腺素合成的限速酶在炎癥中起重要作用，而且參與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及促進(jìn)其轉(zhuǎn)移與侵襲。COX-2主要表達(dá)在新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞和形成血管的細(xì)胞中，通過影響VEGF參與腫瘤新生血管的形成［1-2］。在人結(jié)腸癌羥基喜樹堿（Hydroxycamp－tothecin，HCPT）多藥耐藥細(xì)胞株（簡稱SW1116/ HCPT）中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome proliferator-activated receptors-α，PPARα）下調(diào)了105倍［3］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，COX-2的表達(dá)在該耐藥細(xì)胞中也是明顯下調(diào)的。為了明確PPARα、COX-2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用，探討可能相關(guān)的信號(hào)通路的效應(yīng)分子，我們假定PPARα可能在某種程度上發(fā)揮對(duì)COX-2調(diào)節(jié)作用，并以此為基礎(chǔ)，通過檢測(cè)COX-2的作用底物PGE2，了解PPARα激動(dòng)劑WY-14643對(duì)COX-2的活性和蛋白表達(dá)影響，進(jìn)一步推測(cè)PPARα對(duì)COX-2調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1．細(xì)胞株和干擾質(zhì)粒

人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞株，人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞株（簡稱為SW1116/HCPT），由仁濟(jì)醫(yī)院消化科冉志華教授提供，該多藥耐藥細(xì)胞株是通過藥物濃度梯度法誘導(dǎo)建立［3］，該細(xì)胞株凍存前培養(yǎng)于含羥基喜樹堿（濃度為1 μg/mL）的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，復(fù)蘇后培養(yǎng)于無羥基喜樹堿的RPMI-1640完全培養(yǎng)液3～5代后用于實(shí)驗(yàn)。PPARa干擾質(zhì)粒由課題組童錦祿博士構(gòu)建完成并保存，載體為p-RNAT-U6.1/neo［4］。

2．主要試劑

脂質(zhì)體2000（美國Invitrogen公司）；羥基喜樹堿（HCPT）：長春天誠藥業(yè)有限公司；ELISA-PGE2試劑盒：美國R&D公司（貨號(hào)KGE004）；PGE2：美國SIGMA公司（貨號(hào)P0409）；WY-14643：（美國SIGMA）；MK-886：（美國SIGEMA）；RKIP：兔抗人多克隆抗體（Santa Cruz，貨號(hào)sc-28837）；COX-2：山羊抗人多克隆抗體（美國Abcam，貨號(hào)ab23672）；PPARα：鼠抗人單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號(hào)ab2779）；HRP標(biāo)記的小鼠抗人GAPDH多克隆抗體（上?？党缮?，貨號(hào)KC-5G5）。

二、主要方法

1．實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（1）Trizol法分別抽提細(xì)胞RNA：SW1116細(xì)胞和人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細(xì)胞SW1116/ HCPT細(xì)胞，每孔3×105接種于六孔板，待細(xì)胞生長匯度達(dá)85%～95%時(shí)，Trizol法分別抽提兩組細(xì)胞RNA，紫外分光光度法檢測(cè)RNA濃度分別為1.41 μg/uL、1.35 μg/uL；并用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA分子完整性。

（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA。在RNA酶滅活的0.2 mL PCR管中配置20 μL如下反應(yīng)體系：5× PrimeScripBuffer 2.0 μL，PrimeScripRT Enzyme MixI（10 mM）0.5 μL，Oligo dT Primer，Random primer各0.5 μL，總RNA≤1.0 μg，最后加入RNase free H2O至20 μL；37℃15 min--85℃5 s --4℃維持，得到RT反應(yīng)液，即cDNA模版。

（3）Real-Time PCR。配置20 μL如下反應(yīng)體系：SYBRPremix Ex TaqTMI（I2×）10.0 μL，F(xiàn)orward Prime（r10 μM）0.8 μL，Reverse Prime（r10 μM）0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，RT反應(yīng)液≤2.0 μL，最后加RNase free H2O至20 μL，反應(yīng)條件：95℃30 s--95℃5 s，60℃31 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)--72℃45 s。

（4）結(jié)果計(jì)算：每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。記錄各孔的Ct值。每個(gè)樣品的Ct值以3個(gè)復(fù)孔的平均Ct值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用經(jīng)典的2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算：△Ct（目的基因）=目的基因Ct值-內(nèi)參對(duì)照基因的Ct值，△△Ct=△Ct（目的基因）-△Ct（標(biāo)準(zhǔn)值），目的基因的相對(duì)總量為2-ΔΔCt。Ct值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與miRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，即CT值越高，說明miRNA表達(dá)水平越低。

2．Western blot檢測(cè)COX-2的蛋白表達(dá)

（1）實(shí)驗(yàn)分組：細(xì)胞均接種于六孔板，3×105/孔。①SW1116細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒和PPARα干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染72 h后檢測(cè)PPARα干擾質(zhì)粒對(duì)PPARα蛋白水平的抑制情況；②人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞株，每孔加入培養(yǎng)液2 mL，12 h后予以PPARα激動(dòng)劑WY-14643進(jìn)行干預(yù)，終濃度分別為50 μM、100 μM、250 μM，陰性對(duì)照為同等濃度的DMSO加培養(yǎng)液，干預(yù)48 h后，抽提蛋白；③SW1116細(xì)胞和人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞，分別收集細(xì)胞總蛋白。

（2）實(shí)驗(yàn)方法：用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液細(xì)胞，抽提細(xì)胞總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，配置10%分離膠，4%的基層膠，上樣，每孔加入50 μg蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗，二抗孵育，洗膜，化學(xué)發(fā)光；同上操作進(jìn)行內(nèi)參照GAPDH檢測(cè)，ImageJ 1.5軟件分析條帶灰度值。

3．ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量

（1）實(shí)驗(yàn)分組：同western blot，細(xì)胞接種于六孔板，3×105/孔，每孔最終培養(yǎng)液體積為1.5 mL。①轉(zhuǎn)染后24 h，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；②WY-14643進(jìn)行不同濃度干預(yù)，作用24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；③接種48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。

（2）制備PGE2不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，工作液及待測(cè)樣品：①按濃度梯度稀釋法，配置濃度分別為2 500 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/ mL的PGE2工作液。配置好的PGE2工作液在60 min內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。②取20 mL洗脫液，加入雙蒸水，1：25倍稀釋后放于4℃?zhèn)溆?。③將過氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺等體積混勻，配置成底物反應(yīng)溶液，15 min內(nèi)避光備用。

（3）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清：取0.5 mL培養(yǎng)上清，加入0.5 mL 800 mol/L乙醇及10 μL冰醋酸輕微混合，室溫靜置5 min，以4 000 g離心10 min，清除培養(yǎng)液中殘留的顆粒和細(xì)胞，取上清放入1.5 mL無菌EP管中，立即檢測(cè)。

（4）ELISA操作方法：①將RD5-39稀釋液200 μL加入NSB（非特異性結(jié)合孔，只加樣品，不加抗體）。RD5-39稀釋液150 μL加入B0孔。將待檢測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品工作液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔150 μL，每個(gè)待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)三個(gè)復(fù)孔；②每孔依次加入50 μL PGE2的一抗（NSB除外），50 μL PGE2Conjugate，粘附貼條覆蓋，室溫下避光孵育2 h；③小心除去孔內(nèi)的混合液，每孔加入400 μL稀釋后洗脫液，停留數(shù)分鐘后，將96孔板倒置于干凈的紙巾上，多次扣板，到紙巾上無水漬出現(xiàn)為止；共洗4次；④每孔加入200 μL底物反應(yīng)溶液，室溫避光孵育20 min后，每孔加入50 μL反應(yīng)終止液，微震96孔板，充分混勻；⑤放于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm處測(cè)量各孔的吸光值，校正波長為570 nm；⑥根據(jù)PGE2標(biāo)準(zhǔn)品所測(cè)出的OD值，制作PGE2含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)計(jì)算公式推算待檢樣品中PGE2的含量。

4．流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長期SW1116/HCPT細(xì)胞，3×105/孔接種于六孔板，24 h后給予不同濃度的PGE2進(jìn)行干預(yù)，50 μg/mL的PGE2儲(chǔ)存液，分別取5 μL、0.5 μL加入2 mL RPMI-1640無血清培養(yǎng)液中，使PGE2的最終濃度分別為10-7mol/L，10-8mol/L。干預(yù)48 h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、COX-2在多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞中的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平明顯下降，且伴隨其活性降低

Realtime PCR重復(fù)3次檢測(cè)COX-2在SW1116細(xì)胞，多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)，相對(duì)比為5.65：1；12.895：1；8.195：1；平均8.9133±3.6755；P＜0.05，差異顯著。同SW1116細(xì)胞相比，在耐藥細(xì)胞中，COX-2的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，均降低；即使增加上樣量SW1116/ HCPT中COX-2蛋白表達(dá)仍很低（如圖1）；同時(shí)用ELISA檢測(cè)兩種細(xì)胞在同樣的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2的微量變化，在SW1116/HCPT耐藥細(xì)胞中，PGE2含量明顯降低（［2.5892±0.1510）ng/ mL vs（0.5137±0.0845）ng/mL，P=0.0034］；間接反映了COX-2在兩種細(xì)胞中的活性差別（如圖2）。

圖1　COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)差異

圖2　SW1116、SW1116/HCPT細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2含量

二、PPARα激動(dòng)劑WY-14643促進(jìn)COX-2蛋白表達(dá)，提高COX-2活性

為了進(jìn)一步研究PPARα對(duì)COX-2調(diào)節(jié)作用，我們選擇COX-2表達(dá)相對(duì)比較低SW1116/HCPT細(xì)胞，給予PPARα激動(dòng)劑WY-14643進(jìn)行干預(yù)，用DMSO稀釋至終濃度分別為50 μM、100 μM、250 μM，對(duì)照組均加同等濃度的DMSO（設(shè)為0 μM）；見圖3F中，WY-14643干預(yù)后，同對(duì)照組相比，COX-2蛋白在100 μM、250 μM表達(dá)明顯升高，在50 μM濃度無明顯變化；100 μM和250 μM濃度相比，蛋白表達(dá)水平無明顯變化。見圖3A中，50 μM組，PGE2含量為（0.2675±0.03658）ng/mL vs（0.2443±0.01228）ng/mL（對(duì)照0 μM）；P值為0.2325，無顯著差異；圖3B中，100 μM：（0.5483± 0.0614）ng/mL，P值分別為0.0083，差異顯著；圖3C中，250 μM：（0.7851±0.0203）ng/mL，P值為0.000，差異顯著。此外，我們還進(jìn)行了不同濃度之間的組間比較：圖3D中，50 μM組同100 μM組相比，P值為0.0025；圖3E中，250 μM濃度組同100 μM濃度組相比，P值為0.0098，說明激動(dòng)劑WY-14643在增加COX-2蛋白表達(dá)的同時(shí)，也提高了COX-2酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)PGE2的生成。隨著干預(yù)濃度的增加，PGE2的合成也逐漸增多，存在劑量依賴相關(guān)性。

三、PPARα表達(dá)下調(diào)抑制COX-2蛋白表達(dá)，減少PGE2的合成

在之前的研究中建立了PPARa干擾質(zhì)粒［4］，載體為p-RNAT-U6.1/neo，shRNA 5′CGATCAAGTGACATTGCTAAA 3′。如圖4A所示，PPARa干擾質(zhì)粒下調(diào)PPARα蛋白表達(dá)，COX-2的蛋白表達(dá)也有所下降；圖4B中，同SW1116的轉(zhuǎn)染試劑陰性對(duì)照組相比，PPARα表達(dá)下調(diào)后PGE2的含量均明顯下降。24 h組PGE2含量由對(duì)照組的（2.9405± 0.7167）ng/mL降低為（0.2818±0.0330）ng/mL；48 h組，由對(duì)照組的（2.2300±0.2468）ng/mL下降至（0.5533±0.0100）ng/mL，統(tǒng)計(jì)P值分別為0.0345和0.0107。

圖3　WY-14643對(duì)COX-2蛋白表達(dá)和酶活性影響的測(cè)定

圖4　PPARα表達(dá)下調(diào)對(duì)COX-2蛋白表達(dá)和活性的影響

四、PGE2促進(jìn)SW1116/HCPT細(xì)胞的增殖

細(xì)胞周期的觀察指標(biāo)有細(xì)胞增殖指數(shù)（Proliferation index，PI）和S期細(xì)胞分?jǐn)?shù)（S-phase cell fraction，SPF）。PI反映處于增殖期狀態(tài)的細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。增殖指數(shù)PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S +G2/M）×100%。如圖5所示，給予不同濃度PGE2干預(yù)后，G1比例逐漸降低，而S比例逐漸升高，PI由對(duì)照組的（32.2±2.13）%，上升到（42.2±3.14）%、（52.1±2.43）%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后，通過對(duì)細(xì)胞周期PI的多樣本均數(shù)方差分析，P值為0.0123，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示PGE2可能通過對(duì)細(xì)胞周期的改變來促進(jìn)細(xì)胞增殖。在人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥SW1116/HCPT細(xì)胞株中，由于COX-2表達(dá)水平的下調(diào)，我們推測(cè)在該細(xì)胞中，PGE2的合成也應(yīng)該是減少的，并且通過我們對(duì)SW1116細(xì)胞和SW1116/HCPT細(xì)胞培養(yǎng)上清的ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示PGE2的濃度在后者也是非常低的。

圖5　PGE2對(duì)細(xì)胞周期的影響

討論

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、能量平衡和炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)。研究已表明，PPARα是肝臟線粒體、過氧化物酶體β-氧化和微粒體ω氧化的主要調(diào)節(jié)器［5］。在人類，PPARα主要表達(dá)于心、肝、腎近曲小管、骨骼肌和棕色脂肪等代謝活躍組織；另外，在單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞有較低水平表達(dá)［6］。

環(huán)氧化酶（COX）是前列腺素合成過程中的重要限速酶。COX-2是誘導(dǎo)型同工酶，靜息時(shí)不表達(dá)，在各種細(xì)胞因子、癌基因誘導(dǎo)下高表達(dá)［7］，產(chǎn)生大量COX-2，促進(jìn)組織大量合成前列腺素（prostaglandins，PGs），尤其是前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）介導(dǎo)炎癥、疼痛、發(fā)熱等病理生理過程，通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管形成、抑制細(xì)胞凋亡及免疫功能等機(jī)制，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。在胃癌［8］、肺癌［9］、前列腺癌［10］、胰腺癌［11］等腫瘤組織中高表達(dá)。近年來研究顯示COX-2不僅與結(jié)、直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲［12-13］，COX-2作為一個(gè)促癌基因已受到廣泛研究和關(guān)注。COX-2還受PI3-K/mTOR等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［14］。

人結(jié)腸癌羥基喜樹堿SW1116/HCPT耐藥細(xì)胞株，是研究結(jié)腸癌多藥耐藥的理想模型［4，15］。運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)比研究了SW1116/HCPT耐藥細(xì)胞株與非耐藥SW1116細(xì)胞株在mRNA水平的差異，發(fā)現(xiàn)SW1116/HCPT細(xì)胞中存在多種耐藥相關(guān)基因表達(dá)改變，其中PPARα下調(diào)倍數(shù)高達(dá)105倍［3］。研究表明PPARα表達(dá)缺失導(dǎo)致對(duì)HCPT耐藥的抗腫瘤效應(yīng)，miR-506過表達(dá)可以通過抑制PPARα的表達(dá)，促進(jìn)SW1116/HCPT耐藥細(xì)胞株對(duì)HCPT的耐藥［4］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，同SW1116細(xì)胞株相比，SW1116/HCPT耐藥細(xì)胞株中COX-2的mRNA水平下降了8倍，蛋白水平也明顯下降，并且COX-2的蛋白表達(dá)隨著PPARα表達(dá)下調(diào)而下降。為了進(jìn)一步研究PPARα對(duì)COX-2的調(diào)節(jié)作用，我們采用更敏感的ELISA檢測(cè)法，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2的含量，來間接反應(yīng)COX-2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARα激動(dòng)劑WY-14643在促進(jìn)COX-2蛋白表達(dá)的同時(shí)也提高了COX-2的酶活性表達(dá)，表現(xiàn)為PGE2含量的劑量依賴性升高；我們還利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)PPARα的表達(dá)后，再次檢測(cè)PGE2的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同SW1116轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染PPARα干擾質(zhì)粒的SW1116細(xì)胞，培養(yǎng)上清中PGE2的含量由2.94 ng/mL降低到0.28 ng/ mL；從這兩方面來看，PPARα對(duì)COX-2可能是存在著正向調(diào)節(jié)的關(guān)系，即PPARα可以促進(jìn)COX-2的表達(dá)，PPARα的下調(diào)同樣也抑制了COX-2的表達(dá)。因此我們推測(cè)在結(jié)腸癌多藥耐藥SW1116/ HCPT耐藥細(xì)胞中，存在PPARα/COX-2/PGE2的調(diào)節(jié)機(jī)制，COX-2很可能是PPARα的靶基因。

有關(guān)COX-2的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，阿司匹林及其他非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）能降低大腸癌的發(fā)病率及死亡率并且與COX-2的活性受到抑制有關(guān)［16］。而COX-2受到抑制后，其產(chǎn)物PGE2的合成必將減少。目前的研究發(fā)現(xiàn)PGE2可以通過抑制TNF-α、IFN、IL-1等促進(jìn)腫瘤生長，誘導(dǎo)血管生成，并且可以與細(xì)胞膜受體結(jié)合或者直接進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核受體如PPARδ結(jié)合，誘導(dǎo)K-ras、H-ras、Bcl-2等促癌基因的表達(dá)［17］。本研究的結(jié)果也證明，PGE2可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，因此COX-2的選擇性抑制劑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和侵襲有一定的抑制作用，COX-2選擇性抑制劑具有應(yīng)用于臨床治療結(jié)腸癌的潛在價(jià)值。已有研究表明，COX-2抑制劑雙氯芬酸，可以抑制腫瘤中PI3-K，AKT的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白BcL-2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、caspase-3 and cas－pase-9的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［18］。

在我們的人結(jié)腸癌羥基喜樹堿多藥耐藥細(xì)胞株SW1116/HCPT細(xì)胞中，PPARα的表達(dá)明顯低于親代SW1116細(xì)胞，如果從PPARα對(duì)COX-2正向調(diào)控來說，COX-2表達(dá)的下調(diào)似乎可以用PPARα表達(dá)的下調(diào)來解釋。國外也有相關(guān)的類似研究［19］發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體（PP）可以促進(jìn)COX-2的表達(dá)，這與我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基本上是一致的。此外，國外亦有文獻(xiàn)報(bào)道脫氧膽酸鹽可以通過ERK1/2-P38-MAPKAP-1信號(hào)通路，誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)［20］。有研究表明，PPARα激動(dòng)劑非諾貝特，可以通過抑制氧化應(yīng)激、p38MAPK和JNK的磷酸化，減少自發(fā)性高血壓大鼠的腎臟損害［21］。PPARα激動(dòng)劑還可以通過抑制VEGF誘導(dǎo)的AKT的磷酸化，發(fā)揮抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力［22］。亦有研究表明，PPARα激動(dòng)劑WY-14643可以促進(jìn)ERK、P38的磷酸化，而ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059和U0126則能完全抑制WY-14643誘導(dǎo)的纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）的釋放［23］。根據(jù)以上的理論，WY-14643誘導(dǎo)COX-2表達(dá)增加的機(jī)制則可能是通過ERK1/2-P38-MAPK-AP-1-COX-2信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的［20］。

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（本文編輯：郭彥東）

Role of PPARα/COX-2/PGE2pathway in human drug resistant colon cancer cell line

NIE Fang，ZHAO Xian-yuan，YU Yue-tian，YIN Rong，LI Yu-jie，CAO Jian-guo，GAO Yuan.Department of Intensive Care Medicine，Ren Ji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University.Cao Jian-guo:145 Shandong Middle Rd.Shanghai 200001.E-mail:doctorcjg@hotmail.com.Gao Yuan:1630 Dongfang Rd.Shanghai，China.E-mail:gaoyuanzhuren@126.com.

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.06.006

200001上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

曹建國，E-mail：doctorcjg@hotmail.com；皋源，E-mail：gaoyuanzhuren@126.com

上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃（shjdy043）

2015-07-23）