姚永明，張　帆，張澤敏，閻　賀，吳彩鳳，胡　飛，牛常英，楊彪炳（.濰坊醫(yī)學院山東濰坊6053；.費縣人民醫(yī)院山東臨沂73400）

·基礎(chǔ)研究·

不同配比凍存液對兔脂肪干細胞液氮凍存效果的研究

姚永明1，張帆2，張澤敏1，閻賀1，吳彩鳳1，胡飛1，牛常英1，楊彪炳1
（1.濰坊醫(yī)學院山東濰坊261053；2.費縣人民醫(yī)院山東臨沂273400）

目的：探究不同濃度配比凍存液對脂肪干細胞（Adipose-derived Stem Cells，ADSCs）凍存復蘇后存活率及增殖活性的影響。方法：無菌條件下取新西蘭大白兔的脂肪組織，體外分離、培養(yǎng)ADSCs并傳代至第3代，行免疫細胞化學染色對其表面標志物進行鑒定，同時對其行成軟骨及成表皮細胞誘導以證實其多項分化能力。將第3代ADSCs置于液氮（-196℃）中凍存，根據(jù)凍存液中培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）及二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）的配比不同分為8組：①含不同濃度FBS配比分組：A組（70%DMEM+20%FBS+10%DMSO）、B組（60%DMEM+30%FBS+10%DMSO）、C組（50%DMEM+40%FBS+10%DMSO）、D組（含有40%DMEM+50%FBS+10%DMSO）；②含不同濃度DMSO配比分組：E組（55%DMEM+40%FBS+5%DMSO）、F組（50%DMEM+40%FBS+10%DMSO）、G組（45%DMEM+40%FBS+15%DMSO）、H組（40%DMEM+40%FBS+20%DMSO）。細胞凍存三個月后，對其進行復蘇并觀察細胞形態(tài)學變化；通過細胞計數(shù)計算細胞存活率；采用MTT法繪制復蘇后細胞生長曲線，以測定其生長增殖情況。結(jié)果：細胞復蘇后，通過細胞計數(shù)計算結(jié)果顯示C、D組存活率明顯高于A、B組（P＜0.05），E、F、G、H四組之間有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；MTT法結(jié)果顯示C、D、F組的增殖曲線與未凍存組無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論：從兔脂肪組織中成功分離出了ADSCs，并且能在體外培養(yǎng)過程中穩(wěn)定生長，快速增殖；ADSCs凍存液比例選擇以DMEM：FBS：DMSO=5：4∶1的凍存效果最好。

脂肪來源干細胞；凍存液；液氮

ADSCs是從脂肪組織中提取的干細胞，具有取材方便，來源豐富，體外增殖能力強等優(yōu)點，在組織個過程中得到廣泛應用。然而在體外培養(yǎng)過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的生物學特性會發(fā)生變化，從而在一定程度上影響了ADSCs的生物活性。對于采用液氮（-196℃）進行細胞凍存，理論上是沒有時間限制的，但實際上細胞凍存的時間越長，復蘇后存活率會越低。因此，我們需要找到一種有效減少細胞凍存凋亡的方法，使其活性最大程度的接近正常水平。本實驗以DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入保護劑DMSO以及FBS作為凍存液，調(diào)整凍存液中三者配比比例，對不同配比凍存液復蘇后ADSCs的生物學特性進行觀察，進而篩選出適合ADSCs的最佳配比凍存液，對今后ADSCs不管在科研領(lǐng)域還是在臨床應用方面起到一定的指導性作用。

1　材料和方法

1.1材料

2～3個月齡新西蘭大白兔（購自濰坊醫(yī)學院動物中心），體重2.5～3.0kg，DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMSO液（上海生工生物工程公司），MTT液（北京Solarbio公司），臺盼藍染料（北京Solarbio科技有限公司）

1.2方法

1.2.1 ADSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定：無菌條件下取新西蘭大白兔的新鮮脂肪，在盛有PBS緩沖液的無菌盤中反復沖洗，用眼科剪剪碎至糊狀，1 200r/min離心5min，加入Ⅰ型膠原酶后置于1 900r/min，37℃搖床消化50min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，加入DMEM培養(yǎng)液終止消化、離心，棄上清，留貼壁細胞；用DMEM培養(yǎng)液重懸并接種培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞生長形態(tài)特征。用免疫熒光法檢測ADSCs表面特異性標記物CD34、CD44、CD29及CDl06的表達情況。通過軟骨誘導液誘導其向軟骨方向分化，利用甲苯胺藍染色法檢測結(jié)果，對其行表皮細胞誘導實驗，行免疫熒光檢測其CK19的表達。

1.2.2 ADSCs的分組與凍存方法：①含不同濃度FBS配比分組：A組（70%DMEM+20%FBS+10%DMSO）、B組（60%DMEM+30%FBS+10%DMSO）、C組（50%DMEM+40% FBS+10%DMSO）、D組（含有40%DMEM培養(yǎng)基+50%FBS+ 10%DMSO）；②含不同濃度DMSO配比分組：E組（55% DMEM+40%FBS+5%DMSO）、F組（50%DMEM+40%FBS+10% DMSO）、G組（45%DMEM+40%FBS+15%DMSO）、H組（40% DMEM+40%FBS+20%DMSO）。取第3代的ADSCs，用0.25%胰酶對其進行消化，離心后，收集細胞，向其中加入不同比例組成的凍存液，細胞密度約為5× 106/ml，吹打混勻后分裝入凍存管內(nèi)，每管1ml。先在4℃冰箱中放置30min；然后放入-20℃的冰箱中冷凍60min；接著在-80℃超低溫冰箱中過夜冷凍；之后轉(zhuǎn)入液氮中保存。

1.2.3 ADSCs的復蘇：凍存3個月后，從液氮中取出凍存的細胞，迅速放入37℃水浴箱內(nèi)，輕輕振蕩，使凍存管中的固體快速融化。在超凈工作臺中用滴管將細胞移到離心管中，1 200r/min離心10min，去除凍存液，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液（DMEM中加入10%胎牛血清，1ml谷氨酰胺，0.05g/L L-抗壞血酸，1%青鏈霉素混合液），放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4復蘇后ADSCs的測定

1.2.4.1形態(tài)學觀察：倒置顯微鏡下觀察細胞的生長、增殖情況及細胞形態(tài)學的特征并且進行拍照記錄。

1.2.4.2細胞計數(shù)和細胞存活率的統(tǒng)計：ADSCs懸液與0.4%的臺盼藍染液按4:1的比例混勻，室溫條件下靜置約3 min，采用計數(shù)板統(tǒng)計細胞的密度和細胞的存活率，其中被染成藍色的為死細胞，而活細胞不被染色。

磨河水庫工程水土保持防治工程實施的投資為242.86萬元，較水土保持方案減少42.07萬元，其中工程措施投資減少35.93萬元，植物措施投資減少757萬元，臨時工程投資減少1.57萬元。

細胞的密度（細胞個數(shù)/ml）=（四個大格的細胞的總的數(shù)目/4）×104×細胞被稀釋的倍數(shù)

細胞的存活率（%）=［（細胞總的數(shù)目-死亡的細胞的數(shù)目）/細胞的總的數(shù)目］×100%

1.2.4.3 MTT生長曲線的測定：取復蘇后的細胞加入L-DMEM中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細胞消化成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×104個/ml后分別接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞懸液量為100μl，總共接種7個培養(yǎng)板。每塊培養(yǎng)板分十組：1組～8組分別為不同比例凍存液凍存的實驗組；第9組為未凍存過的對照組；第10組為單純加培養(yǎng)液不加細胞的空白組。另外每組增設3個復孔，邊緣孔用無菌的PBS緩沖液填充。放入培養(yǎng)箱中靜置并且培養(yǎng)。從次日起每天同一時間取出一塊培養(yǎng)板測OD值。具體方法為：向每個含有細胞的孔內(nèi)加入20μl的濃度為5mg/ml的MTT，置于培養(yǎng)箱之中孵育4h后，吸出孔內(nèi)液體，終止培養(yǎng)。然后每孔加入150μl的DMSO之后，將其置搖床上振蕩10min，使結(jié)晶物充分的溶解之后放置到酶聯(lián)免疫檢測儀之上，選在OD值為490nm處測量各個孔的吸光值。1.2.4.4統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）的形式表示，采用SPSS17.0軟件對ADSCs的存活率的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way-ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1　倒置顯微鏡下觀察ADSCs形態(tài)

圖2　顯微鏡下觀察第3代ADSCs

圖3　細胞免疫熒光染色觀察（400×）

圖4　第3代ADSCs分化能力鑒定

2　結(jié)果

2.1脂肪干細胞的鑒定

2.1.1倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)：剛消化分離的的原代ADSCs細胞呈透亮圓形，與少量殘留的紅細胞、結(jié)締組織碎片等共同漂浮于培養(yǎng)液中。4h后逐漸沉降貼壁，細胞體積逐漸增大，呈短梭形或小多角形，24h后存活的細胞基本貼壁，3～4d細胞開始充分的伸展，形成魚群樣聚集。7d左右細胞鋪滿瓶底（見圖1）。傳至第3代，HE染色顯示細胞形態(tài)均勻，呈長梭形（見圖2）。

2.1.2細胞免疫熒光表面抗原及多向分化能力鑒定：用免疫熒光法檢測的結(jié)果是，ADSCs細胞表面的抗原CD29以及CD44呈現(xiàn)陽性表達，而CD34以及CD106呈現(xiàn)陰性表達（見圖3）；ADSCs經(jīng)EGF向表皮細胞誘導，檢測有CK19呈陽性表達；經(jīng)軟骨誘導液誘導ADSCs，顯示胞內(nèi)基質(zhì)均勻藍染（見圖4）。

2.2凍存后復蘇ADSCs的檢測

2.2.1復蘇后ADSCs細胞形態(tài)學及生長狀況：顯微鏡下觀察：凍存細胞復蘇后呈圓形懸浮于培養(yǎng)液中，接種2h后開始有少量細胞貼壁，24h后大部分細胞均已貼壁。細胞形態(tài)由圓形逐漸向梭形、多角形轉(zhuǎn)化。未凍存細胞在接種10min開始貼壁，2h后逐漸伸展呈梭形，多角形。

表1　不同比例凍存液下復蘇后的兔ADSCs復蘇率的比較（±s，%）

表1　不同比例凍存液下復蘇后的兔ADSCs復蘇率的比較（±s，%）

組別不同比例凍存液復蘇率A組70%DMEM+20%FBS+10%DMSO35.00±0.02 B組60%DMEM+30%FBS+10%DMSO40.39±0.02 C組50%DMEM+40%FBS+10%DMSO73.34±0.07 D組40%DMEM+50%FBS+10%DMSO71.82±0.15 E組55%DMEM+40%FBS+5%DMSO18.35±0.06 F組50%DMEM+40%FBS+10%DMSO75.03±0.11 G組45%DMEM+40%FBS+15%DMSO56.68±0.06 H組40%DMEM+40%FBS+20%DMSO38.35±0.08

2.2.3生長曲線測定：復蘇后，脂肪干細胞生長曲線圖大致呈S形，在第1～2天細胞均處于停滯期，但均比未凍存組的開始值低，從第3天開始細胞進入迅速生長期，第5天可達到增殖頂峰。實驗結(jié)果均與以往研究相一致［1］。其中凍存組C、D、F組的增殖曲線與未凍存組無明顯差異，F(xiàn)組更加接近未凍存組，而G組的增殖曲線與未凍存組相比稍低。而其他的組別的增殖曲線與未凍存組相比較低（見圖5）。

圖5　復蘇后ADSCs生長曲線

3　討論

ADSCs來源于胚胎期的中胚層，具有向中胚層的組織和神經(jīng)外胚層的組織等分化的潛力。可以在特定條件下分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、神經(jīng)前體細胞及表皮細胞等多種組織細胞［2-3］。由于體外需要ADSCs的量較大，所以我們需要進行體外分離純化并進行大量的增殖。但是ADSCs在體外長期培養(yǎng)的過程中生物學特性容易發(fā)生改變，從而失去其多分化的潛能。因此及時進行ADSCs的凍存不僅可以減少這種情況還可以節(jié)省時間和減少材料的消耗。細胞的凍存復蘇后的效果、成活率以及生長狀態(tài)直接影響后續(xù)各項生物學實驗的結(jié)果。而細胞的來源、凍存前細胞的活力、凍存時細胞的代數(shù)、凍存的密度、保護劑的選擇和濃度、凍存液中FBS的濃度、降溫以及復溫的程序都會直接影響到凍存效果［4］。所以凍存成功的關(guān)鍵是選擇合適的凍存保護劑、方法、合適的凍存溫度以及凍存時細胞的濃度等［5-6］。

經(jīng)研究表明凍存液對各類細胞都存在破壞作用。細胞在凍存的過程中要經(jīng)歷液相固化以及水分子通過細胞膜的滲透，在這個過程中，會產(chǎn)生融合熱以及溶液的冰晶，這些東西會直接導致細胞的大量死亡［7］。而凍存時細胞的生長、防凍劑的細胞的毒性損害和高滲透壓性也將會對細胞造成到傷害［8］。鑒于降溫速度太快，細胞內(nèi)外同時形成冰晶，將導致細胞損傷，甚至是死亡；而復溫速率太慢，細胞內(nèi)容易形成冰晶，導致細胞的損傷，甚至是死亡，我們選擇慢凍快溶作為凍存復蘇的方式，這一做法明顯地降低了凍存劑對細胞的損害作用。

冷凍保護劑是一類可以通過稀釋溶液中溶質(zhì)的濃度，減少冷凍和解凍過程中對細胞造成損傷的化合物［9］，發(fā)揮作用的機制為在降溫過程中，保護劑透過胞膜進入細胞，進而降低細胞皺縮的程度［10］。DMSO是一種分子質(zhì)量小，溶解度大，具有強穿透細胞膜能力的非電解質(zhì)，并能降低冰點，從而減少其對細胞的毒性作用。研究表明DMSO本身是一種有毒化學試劑，高濃度時對細胞具有一定的毒性［11］。但提前將DMSO4℃冰箱中預冷，可降低其對細胞的毒性［12］。所以在本實驗采用低溫條件下加入DMSO作為保護劑的方法。

從本研究中可以分析得出，當DMSO濃度較低（5%）時，不能有效阻止細胞內(nèi)形成冰晶，從而在凍存過程中對細胞產(chǎn)生了極大的損傷。當DMSO濃度增到20%甚至以上時，不利于細胞復蘇后的成活以及細胞活性的恢復。所以應該嚴格控制DMSO的凍存濃度。本研究結(jié)果表明濃度為10%DMSO凍存液對ADSCs的保護效果較好。FBS本身對細胞就具有保護作用，可以用來中和DMSO對細胞的毒性，所以適當提高其濃度對凍存細胞有保護作用。研究表明：凍存劑中FBS濃度是40%、50%時，ADSCs的凍存復蘇效率最高，均顯著高于FBS含量較低的實驗組，表現(xiàn)為：當FBS含量低于40%時，F(xiàn)BS濃度越高，細胞復蘇率也越高。當FBS濃度高于40%時，F(xiàn)BS濃度的變化對ADSCs復蘇效果的無明顯影響。因此，使用含有40%FBS的凍存液即可滿足對ADSCs凍存復蘇的要求。而選擇40%FBS的另外一個原因是考慮到雖然降溫凍存過程使細胞處于低代謝狀態(tài)，但仍不能完全避免在降溫和復蘇開始階段時，會有部分干細胞因血清等成分的存在而自主分化，從而失去多能性［13］。所以ADSCs的凍存選擇含40%FBS的凍存液較好。

本實驗從經(jīng)濟、合理性考慮，建立了一種較為適合ADSCs短期凍存方法，為解決ADSCs的儲備、材料和時間的節(jié)省提供了有效的方法。而對于更長時間的凍存復蘇率以及對于細胞活力的影響還需要進一步研究證實。

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編輯/張惠娟

Effects of different combinations cryopreservation of rabbit adipose stem cells were frozen in liquid nitrogen effects

YAO Yong-ming1，ZHANG Fan2，ZAHNG Ze-min1，YAN He1，WU Cai-feng1，HU Fei1，NIU Chang-ying1，YANG Biao-bing1
（1.WeiFang Medical Uniwersity，Weifang 261053，Shandong，China 2.Feixian People's Hospital，Linyi 273400，Shandong，China）

Objective To investigate the ability to maintain the proliferation of Adipose-derived Stem Cells（ADSCs）in different concentration ratio of frozen liquid.MethodsFat isolated from healthy rabbits was isolated，cultured and then generated in vitro for 3 passage into the ADSCs，P3 ADSCs were identified by detecting of adipose stem cell surface markers expression.The third passage cells were preserved in liquid nitrogen for 3 months，ADSCs were divided into eight group in order to cryopreservation:groupA:70%DMEM+20%FBS+10%DMSO，groupB:60%DMEM+30%FBS+10%DMSO，groupC:50%DMEM+40%FBS+10%DMSO，groupD:40%DMEM+50%FBS+10%DMSO，groupE:55% DMEM+40%FBS+5%DMSO，groupF:50%DMEM+40%FBS+10%DMSO，groupG:45%DMEM+40%FBS+ 15%DMSO，groupH:40%DMEM+40%FBS+20%DMSO.After cryopreservation three months，observed the cells after recovering，and compared with the group not frozen.The growth curves of the cryopreserved cells were analyzed by MTT assay.Results The results of immunocytochemistryshowed ADSCs were negative for CD34，CD106 and positive for CD29，CD44.Trypan blue staining and microscopic counting of results showed that Group C and Group D had higher cell survival rate than Group A and Group B with significant difference（P＜0.05）.There was significant difference between group E，F(xiàn)，G，H（P＜0.01）.The growth curve showed that there was no significant difference in growth rate of ADSCs between Group C，D，F(xiàn) and control group（P＞0.05）.ConclusionAn experiment successfully separated from the fat rabbit adipose tissue stem cells cultured in vitro with a stable growth process.Adipose stem cells cryopreserved in vitro，frozen liquid ratio selected to DMEM:FBS: DMSO=5:4:1 freezing with the best results.

adipose-derived stem cells；Cryoprotectants；liquid nitrogen

Q813.1

A

1008-6455（2015）09-0029-05

濰坊醫(yī)學院科技創(chuàng)新研究基金資助項目（K11TSl006）

楊彪炳，濰坊醫(yī)學院整形研究所副所長，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，美國加州大學交流學者，中華醫(yī)學會濰坊整形美容學會副主任

2015-03-21

2015-05-13