楊智峰，高玉娟，李敬梅

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

·基礎(chǔ)研究·

甘草顯微定量的方法研究△

楊智峰1*，高玉娟1，李敬梅2

(1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003；2.西安醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710077)

目的：完善甘草顯微定量的方法。方法：在已有顯微定量方法的基礎(chǔ)上，以混懸制樣代替“水飛”制樣，以血球計(jì)數(shù)板代替普通載玻片；利用線性分析方法確定取樣量，用正交試驗(yàn)方法，優(yōu)化制片用混懸液配比和定量需要觀察制片的數(shù)量，進(jìn)行混懸液穩(wěn)定性考察，確定實(shí)驗(yàn)用時(shí)。結(jié)果：樣品細(xì)度要求100目，樣品定量需制片10張，記錄顯微特征個(gè)數(shù)并計(jì)算。結(jié)論：引用血球計(jì)數(shù)板，提高顯微定量的易操作性和準(zhǔn)確性，方法是可行的。

甘草；顯微特征常數(shù)；顯微定量；統(tǒng)計(jì)分析；正交試驗(yàn)

藥材顯微定量的方法研究，康廷國(guó)、苑冬梅教授研究的較多，隨后在中成藥組分定量、中藥炮制方面有應(yīng)用，用混懸劑以“水飛”方法制樣，利用傳統(tǒng)載玻片、蓋玻片、微量進(jìn)樣器、網(wǎng)格式測(cè)微尺和顯微鏡進(jìn)行，每個(gè)樣品制片5～10張[1-6]。理論根據(jù)在于，單位藥材樣品顯微特征個(gè)數(shù)是常數(shù)。其缺點(diǎn)在于：“水飛”方法制樣誤差較大，顯微進(jìn)樣器的孔徑難以滿足要求，定量溶液制片不易操作，全蓋玻片觀察計(jì)數(shù)困難很大，誤差不易控制，局部計(jì)數(shù)體積難以確定，因此該法需要完善。

筆者對(duì)甘草顯微定量方法進(jìn)行了改進(jìn)。用混懸劑以定量混懸的方法制樣，利用血球計(jì)數(shù)板、蓋玻片、定量滴管和顯微鏡進(jìn)行，理論根據(jù)和樣品制片數(shù)同上，希望能提高顯微定量法的精度，便于應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)用品、儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)用品及儀器

血球計(jì)數(shù)板，蓋玻片，樣品盒，10 mL容量瓶，定量滴管。千分之一電子天平，Olmypus顯微鏡(使用鏡頭15 mm×10 mm)，烘箱，沖筒，100目套篩。

1.2 材料

化學(xué)純甘油、水合氯醛和蒸餾水。

共收集15份甘草樣品，其中1～5號(hào)采自陜西神木縣(批號(hào)：20120825、20120826、20130821、20130823、20140920)，6～15號(hào)為市售甘草(西安萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)：20111128、20120816、20130412、20130618、20140311、20111026、20120815、20130810、20140615、20140721)，所有樣品經(jīng)本文第一作者鑒定，1～10號(hào)為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根，11～15號(hào)為脹果甘草GlycyrrhizainflataBat的干燥根。

2 方法

2.1 樣品粉碎

由于血球計(jì)數(shù)板空間高度為0.1 mm，即100 μm，計(jì)算甘草樣品粉碎應(yīng)為100目。預(yù)試驗(yàn)證明，100目甘草樣品，易于制成混懸液，初步穩(wěn)定性考察可在30 min以上。取甘草樣品，悶潤(rùn)，切片，65 ℃烘干，沖筒粉碎，不留殘?jiān)^(guò)100目篩，細(xì)粉備用。

2.2 制樣

取甘草樣品粉末適量(多在100 mg以下)，加水合氯醛液適量，再加一定濃度的稀甘油適量，振搖混懸，定容于10 mL容量瓶中，振搖混勻，備用。

2.3 血球計(jì)數(shù)板樣品池充液量

經(jīng)測(cè)量和計(jì)算，一個(gè)樣品池需混懸液約0.02 mL。

2.4 滴管液滴大小考察

取滴管，吸取1 mL混懸液，10次，記錄1 mL混懸液滴出液滴的數(shù)量，并記錄，經(jīng)計(jì)算1滴約0.046 mL能滿足樣品池充液要求。

2.5 制片

用驗(yàn)證過(guò)的滴管(1 mL溶液，滴20滴左右)，滴一滴，進(jìn)入蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板樣品池中，兩個(gè)樣品池各一滴，即成。

2.6 顯微觀察

每個(gè)樣品制片10張，觀察、記錄20個(gè)數(shù)據(jù)，因每個(gè)計(jì)數(shù)板有兩個(gè)樣品池，要求2 h內(nèi)完成，此由顯微特征在混懸液中的穩(wěn)定性決定。

2.7 樣品計(jì)數(shù)顯微特征的確定

計(jì)數(shù)顯微特征在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，形態(tài)上沒(méi)有變化，如部分溶解，同時(shí)要易于觀察。

2.8 顯微特征個(gè)數(shù)和藥材顯微特征常數(shù)的計(jì)算

由于血球計(jì)數(shù)板一個(gè)樣品池中大方格體積為0.4 mm3，計(jì)數(shù)僅計(jì)大方格中顯微特征個(gè)數(shù)，若以n張片子中顯微特征個(gè)數(shù)(X)為基數(shù)，則10 mL樣品液中顯微特征個(gè)數(shù)(Y)的計(jì)算公式：Y=12 500X/n。10 mL樣品混懸液中藥材質(zhì)量(M，mg)，該藥材顯微特征常數(shù)(K)為：K=Y/M(個(gè)·mg-1)。

3 實(shí)驗(yàn)

3.1 混懸液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取甘草樣品適量(陜西神木，批號(hào)：20120826，51.5 mg)，加混懸液(由60%稀甘油和水合氯醛試液組成，比例19∶1)，定容于10 mL容量瓶中，搖勻，每隔20 min制片1次，每次10張，比較前后計(jì)數(shù)情況，RSD=0.95%，確定溶液穩(wěn)定的時(shí)間為2 h。

3.2 線性范圍考察

取甘草樣品(陜西神木，批號(hào)：20120826)0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、010 g，用60%稀甘油和水合氯醛試液，定容于10 mL容量中，配比19∶1，各樣品制片10張，記錄顯微特征個(gè)數(shù)，進(jìn)行單位質(zhì)量與顯微特征個(gè)數(shù)關(guān)系的回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，與相關(guān)系數(shù)臨界值相比，高度相關(guān)，回歸方程：Y=423.433 1X+122 153，r=0.996 7，線性范圍在40～100 mg。

3.3 制片影響因素的考察

從預(yù)試驗(yàn)情況看，影響顯微特征計(jì)數(shù)的因素有稀甘油濃度、稀甘油與水合氯醛試液配比和觀察片子的數(shù)量。故進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，樣品細(xì)度100目，取樣量50～60 mg，因素水平安排見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 制片正交試驗(yàn)因素水平表

觀察方法：取樣，稱量，用規(guī)定溶液或試劑，按一定比例，混懸樣品，定容于10 mL容量瓶中；取血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋玻片，用滴管給每個(gè)樣品池滴液一滴，注滿，一次制夠所需片數(shù)，置顯微鏡下觀察，記錄每個(gè)樣品池大方格中顯微特征個(gè)數(shù)，按上法計(jì)算顯微特征常數(shù)(個(gè)·mg-1)。

從方差分析情況可知，實(shí)驗(yàn)用甘油溶液濃度對(duì)顯微特征常數(shù)確定影響非常顯著，觀察片數(shù)對(duì)其影響顯著，綜合極差和用時(shí)情況，最終確定顯微定量方法：取樣，稱量，用60%甘油溶液和水合氯醛試液(19∶1)混懸，用血球計(jì)數(shù)板制片10張；觀察，計(jì)算即可。

表2 制片正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.10(2，2)=9。

3.4 重復(fù)性考察

稱取甘草樣品(陜西神木，批號(hào)：20120826)6份，每份約50 mg，用60%甘油液和水合氯醛試液，19∶1混懸，定容于10 mL容量瓶中，每份制片10張，記錄并計(jì)算顯微特征常數(shù)，均數(shù)1 490.5個(gè)·mg-1，RSD=1.47%，重復(fù)性好。

3.5 樣品顯微特征常數(shù)均數(shù)的確定和不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的比較

取神木甘草、甘肅甘草和隴西甘草，約50 mg，各3份，以確定方法制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄顯微特征個(gè)數(shù)，計(jì)算樣品顯微特征常數(shù)均值，分析不同產(chǎn)地樣品均數(shù)之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。用SPSS17軟件進(jìn)行成對(duì)資料統(tǒng)計(jì)分析，神木樣品與甘肅樣品的顯微特征常數(shù)均值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，置信系數(shù)為0.01；神木樣品與隴西樣品的顯微特征常數(shù)均值之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，置信系數(shù)為0.01。

表4 不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)

4 結(jié)果

血球計(jì)數(shù)板用于甘草顯微定量是可行的，具體方法：取過(guò)100目篩樣品適量，加入水合氯醛試液1份，然后加入60%甘油19份，混懸定容于10 mL容量瓶中，用確定過(guò)液滴大小的滴管，吸取一滴，滴于已蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板上，充滿樣品池，制片10張，置顯微鏡下觀察，記錄四個(gè)大方格內(nèi)的顯微特征個(gè)數(shù)，計(jì)算即可。從重復(fù)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的RSD看實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng)。血球計(jì)數(shù)板樣品池高度一定，樣品池計(jì)數(shù)面積一定，故可提高樣品的觀察精度。

5 討論

不同產(chǎn)地樣品顯微特征常數(shù)的均值差異，是植物種間差異和產(chǎn)地差異共同作用的結(jié)果，物種差異影響較大，產(chǎn)地差異影響較小，可以肯定的是，神木產(chǎn)甘草與甘肅產(chǎn)甘草不同。

從本研究看，顯微特征常數(shù)是一個(gè)區(qū)間，這個(gè)區(qū)間受物種、生長(zhǎng)年限和產(chǎn)地影響，但在一定范圍之內(nèi)，具體情況將在后續(xù)研究報(bào)告中予以詳述。

[1] 陳聰慧，康廷國(guó).金銀花顯微特征常數(shù)與化學(xué)成分相關(guān)性研究[J].中藥材，2011，34(9)：1373-1376.

[2] 張洪春，君海波，王婷，等.老鸛草類藥材的顯微定量研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(5)：155-156.

[3] 苑冬梅，劉揚(yáng)，欒曉靜，等.黃柏的顯微定量研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，25(5)：964-966.

[4] 苑冬梅，欒曉靜，鞠慶波，等.中藥顯微定量法的應(yīng)用研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2006，33(4)：459-460.

[5] 劉歆韻，康廷國(guó).逍遙丸中白芍、茯苓的顯微定量研究[D].大連：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[6] 吳楠，康廷國(guó).杞菊地黃丸中菊花、八珍益母丸中益母草顯微定量研究[D].大連：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

AStudyofMicro-quantitativeMethodsforLicorice

YANGZhifeng1，GAOYujuan1，LIJingmei2

(1.ShaanxiAcademyoftraditionalChinesemedicine，Xi’an，710003，China； 2.FirstAttachedHospitaltoXi’anMedicalCollege，Xi’an710077，China)

Objective：To improve the micro-quantitative methods for licorice.Methods：Based on existing micro-quantitative methods，“ShuiFei” example preparation pattern (the process by which solid powder and liquid are grinded together in order to make suspension or remove contaminants) replaced by suspending example preparation pattern，and substitute blood counting plates for microscope slides.Sampling number was determined by linear analysis.The proportion of suspension for plates making as well as the number of sampling plates needed to be observed to confirm the quantity were optimized by orthogonal experiment method，then the inspects on suspension stability was casted and experiments time was confirmed.Results：It turned out that sampling fineness should be 100 mesh，and determination of sample quantity needed 10 slides.After the preparation，the number of micro-characteristics of samples was counted and calculated.Conclusion：It is a practical way by using blood counting plates to increase the handle ability and accuracy of micro-quantitative method.

Licoricer；micro-characteristic constant；micro-quantitation；statistic analysis；orthogonal experiment

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.013

2014-12-03)

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2012K19-03-08)

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楊智峰，研究員，研究方向：生藥學(xué)和中藥鑒定；E-mail：yzfeng_001@163.com