朱如彩，譚電波，秦優(yōu)，梁雪娟，張水寒，黃惠勇

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同采收時期雪峰蟲草中腺苷含量的動態(tài)變化△

朱如彩，譚電波，秦優(yōu)，梁雪娟，張水寒*，黃惠勇*

(湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013)

目的：通過研究不同采收期雪峰蟲草腺苷含量的動態(tài)變化，為確定雪峰蟲草的最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，以C18柱，磷酸鹽緩沖液(PH6.5)-甲醇(85∶15)為流動相；在260 nm波長處測定不同采收期雪峰蟲草中腺苷的含量。結(jié)果：不同時期采收的雪峰蟲草中腺苷含量存在差異，以8～12月份較高。結(jié)論：確定8～12月為雪峰蟲草的最佳采收期。

雪峰蟲草；腺苷；高效液相色譜法；采收期；動態(tài)變化

雪峰蟲草為線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌OphiocordycepsxuefengensisT.C.Wen,R.C.Zhu,J.C.Kang & K.D.Hyde寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，為線蟲草菌科線蟲草菌屬的一個新種[1]，首次發(fā)現(xiàn)于湖南省洞口縣雪峰山，經(jīng)鑒定是目前同屬真菌中與冬蟲夏草親緣關(guān)系最近的一個種[1]，具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰的功效，主治腎虛精虧、陽痿遺精、腰膝酸痛、久咳虛喘等癥，主要功效成分有腺苷、蟲草素、D-甘露醇、多糖、氨基酸等。藥理學(xué)研究表明雪峰蟲草具有補(bǔ)腎壯陽、止咳化痰、增強(qiáng)免疫功能等作用。

雪峰蟲草自晚唐年間就在湖南洞口瑤族民間秘密使用，后來廣泛流傳并用來防病治病，距今已有千余年的歷史。當(dāng)?shù)卮蠖鄶?shù)老百姓將雪峰蟲草煎煮、燉服、泡酒服用，以提高免疫力，強(qiáng)身健體，防癌治癌，普遍反映效果顯著，現(xiàn)有市場供不應(yīng)求，是開發(fā)前景廣闊的蟲草類品種，本研究是為雪峰蟲草申報湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的研究，為雪峰蟲草的產(chǎn)品開發(fā)奠定法定標(biāo)準(zhǔn)。

腺苷為《中華人民共和國藥典》2010版冬蟲夏草項(xiàng)下含量測定成分[2]，是冬蟲夏草的主要活性成分；文獻(xiàn)[3-7]報道蟲草屬真菌的活性成分之一為腺苷，故本研究選擇腺苷作為測定指標(biāo)，用HPLC測定雪峰蟲草中腺苷在不同采收時期的含量動態(tài)變化，為雪峰蟲草最佳采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器：LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10A紫外檢測器(日本島津公司)，N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)，AE240型電子分析天平(METTLER)，HX-06超聲波清洗器(武漢恒信世紀(jì)科技有限公司)。

1.2 試劑與藥品

腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110879-200202)；雙重蒸餾水；甲醇為色譜純；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 樣品

24批次樣品均采集于洞口縣，由洞口縣老年科技工作者協(xié)會、洞口縣富康生物科技有限責(zé)任公司提供(見表1)。

表1 雪峰蟲草采集信息表

注：“S”為2012年采集的樣品；“S′”為2013年采集的樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

Hypersil ODS2 C18色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)[取0.01 mol·L-1磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol·L-1磷酸氫二鈉31.5 mL，混合(PH6.5)]-甲醇(85∶15)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃。理論板數(shù)按腺苷峰計算應(yīng)不低于2000，分離度不低于1.5。

2.2 對照品溶液的制備

取腺苷對照品適量，精密稱定，加90%甲醇制成每1 mL含20μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入15%甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用15%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

以提取溶劑15%甲醇作為陰性對照溶液。

2.5專屬性試驗(yàn)

精密吸取腺苷對照品溶液、陰性對照溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在2.1項(xiàng)的色譜條件下測定其峰面積。結(jié)果顯示陰性對照溶液無干擾吸收峰。見圖1、2、3。

圖1 雪峰蟲草對照品液相色譜圖

圖2 缺雪峰蟲草的陰性對照液相色譜圖

圖3 雪峰蟲草供試品液相色譜圖

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取腺苷對照品溶液(21.2 μg·mL-1)2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜儀，在2.1項(xiàng)的色譜條件下測定其峰面積。以腺苷量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)，并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果腺苷在42.4～212 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=2023.9X-2451.9(r2=0.999 9)。

圖4 腺苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取雪峰蟲草(編號：S4)制成的供試品溶液10 μL，在2.1項(xiàng)的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜峰面積。結(jié)果腺苷峰面積的RSD 1.12%，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性考察

取雪峰蟲草(編號：S4)制成供試品溶液，在2.1項(xiàng)的色譜條件下分別放置0、2、4、6、8、10、12 h各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果腺苷峰面積的RSD為1.88%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(編號：S4)的雪峰蟲草樣品平行制備供試品溶液6份，在2.1項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄色譜峰的峰面積，計算含量。結(jié)果腺苷的平均含量為0.031%，RSD為2.66%，表明重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

精密稱取己知腺苷含量的雪峰蟲草(編號：S4)樣品6份，每份精密加入腺苷對照品適量，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在2.1項(xiàng)的色譜條件下測定，記錄峰面積，計算腺苷的加樣回收率。結(jié)果腺苷的平均回收率為97.09%，RSD為1.14%。

2.11 不同采收期雪峰蟲草樣品腺苷的含量測定

取各批次雪峰蟲草粉末0.5g，精密稱定，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，結(jié)果見表2。

表2 不同采收期雪峰蟲草樣品腺苷的含量測定

2.12 結(jié)果分析

通過對不同時間采集的雪峰蟲草樣品進(jìn)行腺苷含量測定，以月份為橫坐標(biāo)，腺苷含量為縱坐標(biāo)，繪制腺苷含量變化曲線圖(見圖5)。結(jié)果表明：從2012年和2013年每月采集的樣品來看，均以8～12月采集的雪峰蟲草中腺苷含量較高；2012年5月至

圖5 不同采收時期雪峰蟲草腺苷含量變化曲線圖

7月樣品的腺苷含量顯著低于其它月份采集的樣品，可能與當(dāng)年該時期正處于雨水高峰期有關(guān)；結(jié)合雪峰蟲草的生長特性，確定8～12月為雪峰蟲草的最佳采收期。

3 討論

腺苷含量測定供試品溶液制備方法的確定，是經(jīng)不同提取方法(回流法、超聲處理法)、不同提取溶劑(水、15%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇)、不同提取時間(15 min、30 min、45 min)的比較而擬定的，以15%甲醇為提取溶劑，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，提取最完全，所測樣品的腺苷含量最高。

[1] Wen TC，Zhu RC，Kang JC，et al.Ophiocordycepsxuefengensissp.nov.from larvae ofPhassusnodus(Hepialidae)in Hunan Province，southern China[J].Phytotaxa，2013，123(1)：41-50.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2010，106

[3] 王利，陳衛(wèi)東.HPLC法測定蛹蟲草中腺苷和蟲草素的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24(5)：72-73

[4] 喻東，陳璐，國錦琳，等.涼山蟲草的研究綜述[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(8)：2024-2025

[5] 張秀波，劉玉升.泰山蟲草的研究進(jìn)展[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報，2009，31(3)：280-284

[6] 索菲婭，蘇俊，姜彥成，等.新疆蟲草與冬蟲夏草中腺苷和蟲草素的HPLC法測定比較[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2008，(3)：65-67

[7] 孫迎節(jié)，呂鵬，凌建亞，等.九州蟲草的核苷類成分及不同部位兩種活性成分含量的分布[J].藥學(xué)學(xué)報，2003，38(9)：690-694.

StudyonDynamicChangesofAdenosineinOphiocordycepsxuefengensisfromDifferentHarvestTime

ZHURucai，TANDianbo，QINYou，LIANGXuejuan，ZHANGShuihan*，HUANGHuiyong*

(HunanAcademyofChineseMedicine，Changsha410013，China)

Objective：According to the study on dynamic changes of adenosine in different harvest time ofOphiocordycepsxuefengensis，providing a scientific basis to the best harvest time ofO.xuefengensis.Methods：Using a HPLC method for gradient elution，the mobile phase was a mixture of phosphate buffer(PH 6.5)-methanol (85：15)，and the detection wavelength was set at 260 nm.The content of adenosine in different harvest time was tested.Results：There are differences in adenosine content in different harvesting time ofO.xuefengensis，reached to the to Pat August to December.Conclusion：Determine August to December is considered to be the best harvest time ofO.xuefengensis.

Ophiocordycepsxuefengensis；adenosine；HPLC；harvest time；dynamic changes

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.11.016

2015-03-16)

湖南省科技重大專項(xiàng)(2014FJ1007)；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項(xiàng)目(201267、201322)；中醫(yī)藥公共衛(wèi)生專項(xiàng)“國家基本藥物所需中藥原料資源調(diào)查和監(jiān)測項(xiàng)目”(財社[2011]-76)

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張水寒，研究員，研究方向：中藥資源綜合開發(fā)利用；E-mail：zhangshuihan0220@126.com； 黃惠勇，教授，研究方向：中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究；E-mail：hntcmakj@163.com