歐陽華偉，譚　軍，李高峰，雷　穎，劉　宇

（湖南省人民醫(yī)院1.整形&激光美容科；2.病理科　湖南　長沙　410013）

·基礎(chǔ)研究·

點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕后P物質(zhì)的變化

歐陽華偉1，譚軍1，李高峰1，雷穎1，劉宇2

（湖南省人民醫(yī)院1.整形&激光美容科；2.病理科湖南長沙410013）

目的：探討點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕中P物質(zhì)的變化情況。方法：建立兔耳增生性瘢痕模型，點陣CO2激光治療后，免疫組化檢測P物質(zhì)的表達。結(jié)果：點陣CO2激光治療后第1天P物質(zhì)表達評分為1.33±0.50，第4天為7.67±1.58，治療后第7天評分為4.00±1.41，第14天評分為1.56±0.88，第4天與第1天比較，第7天與第4天比較，第14天與第7天比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕后P物質(zhì)表達先升高后降低，這可能與點陣CO2激光參與創(chuàng)面再生修復(fù)有關(guān)。

P物質(zhì)；點陣CO2激光；增生性瘢痕；兔；瘢痕模型

點陣CO2激光治療瘢痕臨床效果確切［1-4］，但激光治療瘢痕后創(chuàng)面愈合的機制尚不明確。我科在研究愈合機制時發(fā)現(xiàn)，點陣CO2激光啟動和激活了表皮干細胞，促進創(chuàng)面原位再生修復(fù)［5］。P物質(zhì)是一種廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有眾多生物活性的神經(jīng)肽，它不僅可直接促進內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的DNA合成和細胞增殖，還可促進新生血管的合成，它在創(chuàng)傷愈合的炎性反應(yīng)、組織細胞增殖、修復(fù)重建等階段都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［6-9］，而且目前已知P物質(zhì)參與了表皮干細胞的遷移、分化和調(diào)控［10］，但點陣CO2激光修復(fù)瘢痕后P物質(zhì)的表達情況如何，目前鮮有報道。本實驗通過觀察點陣CO2激光修復(fù)兔耳增生性瘢痕后創(chuàng)面愈合過程中P物質(zhì)的表達變化，進一步探討激光治療瘢痕后創(chuàng)面愈合的機制。

1　材料和方法

1.1材料

新西蘭大白兔購自長沙開福區(qū)東創(chuàng)動物中心；檸檬酸鹽抗原修復(fù)液，PBS溶液購自北京中杉金橋生物；P物質(zhì)抗體購自長沙艾佳生物技術(shù)有限公司；濕潤燒傷膏產(chǎn)自汕頭市美寶制藥有限公司。

1.2方法

1.2.1建立兔耳增生性瘢痕模型［11-13］：3只新西蘭大白兔分籠飼養(yǎng)一周后造模。每只兔左右兩耳腹側(cè)各標記約1.5cm×1.5cm正方形切口4處，兩創(chuàng)面間隔約1cm。絡(luò)合碘消毒后用2%利多卡因+1∶20萬單位腎上腺素做局部浸潤麻醉，完整切除皮膚全層至軟骨膜表面，刮除軟骨膜，保留兔耳軟骨。創(chuàng)面止血后再次絡(luò)合碘消毒并予以暴露。每日絡(luò)合碘換藥一次，待創(chuàng)面自行愈合、脫痂。三周內(nèi)創(chuàng)面全部痂皮脫落完全痊愈，并逐漸形成突出于正常皮膚的紅色瘢痕，術(shù)后60d所形成的瘢痕呈淡紅色，表面平整，高出平面，質(zhì)軟。共24處。

1.2.2激光治療與標本制備：造模成功后，點陣激光Deep FX模式（20mj，300HZ，15%Density）對瘢痕進行治療，治療后創(chuàng)面予以濕潤燒傷膏換藥，每12h一次，換藥兩周。于治療后1d、治療后4d、治療后7d、治療后14d切取瘢痕組織。所取組織10%甲醛固定，石蠟包埋。標本行免疫組化染色，觀察P物質(zhì)表達。

1.2.3免疫組化檢測P物質(zhì)表達：脫蠟，水化，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，雙氧水過氧化物酶阻斷，血清封閉，1∶300 P物質(zhì)抗體4℃過夜，生物素標記的二抗室溫孵育，多聚酶復(fù)合物孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4結(jié)果判斷［14-16］：細胞漿內(nèi)有黃色或棕黃色為P物質(zhì)表達陽性細胞，主要分布于真皮乳頭層，真皮血管以及毛囊、腺體周圍。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色強度和細胞染色細胞百分率進行評定和分析：每例標本選取10個高倍鏡（×400）視野觀察，陽性細胞占計數(shù)細胞的百分率：＜5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；76%～100%計4分。染色強度：無色計0分；淡黃色，為弱陽性，計1分；棕黃色，為中等染色強度，計2分；棕褐色，為強陽性，計3分。兩者計分相乘以評價P物質(zhì)表達強度∶0為無表達，1～3為可疑表達，4～6為弱表達，7～12為強表達。

1.2.5統(tǒng)計學分析：數(shù)值用平均值±標準差（x±s）表示，SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

點陣CO2激光治療后，第1天及第4天可見激光治療的孔道及熱損傷帶（圖1，圖2箭頭所示），第7天及第14天未見激光治療的孔道及熱損傷帶（圖3、圖4）。P物質(zhì)呈片狀散在分布于成纖維細胞及血管周邊，但表皮基底層未見明顯P物質(zhì)表達。點陣CO2激光治療后，第1天P物質(zhì)表達（圖5）評分為1.33±0.50，第4天P物質(zhì)表達（圖6）評分為7.67±1.58，與第1天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.46，P＜0.05）。治療后第7天P物質(zhì)表達（圖7）評分為4.00±1.41，與第4天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.19，P＜0.05），治療后第14天P物質(zhì)表達（圖8）評分為1.56±0.88，與第7天比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.40，P＜0.05），P物質(zhì)表達先升高后降低（圖9）。

圖1　治療后第1天（×100）

圖2　治療后第4天（×100）

圖3　治療后第7天（×100）

圖4　治療后第14天（×100）

圖5　治療后第1天（×400）

圖6　治療后第4天（×400）

圖7　治療后第7天（×400）

圖8　治療后第14天（×400）

圖9　點陣激光治療后P物質(zhì)表達變化

3　討論

1931年Von Euler和Gaddum在馬腸中提取乙酰膽堿時發(fā)現(xiàn)，一種粉末狀物質(zhì)，具有特殊的生物學和化學特性，并與已知的組織胺和腺嘌呤等中樞肽不同，因當時不知道其具體成分，故取其性狀“粉末”（Power）的首字母命名［17］。后來研究發(fā)現(xiàn)，P物質(zhì)是一種廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有眾多生物活性的神經(jīng)肽，它不僅可直接促進內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的DNA合成和細胞增殖，還可促進新生血管的合成，它在創(chuàng)傷愈合的炎性反應(yīng)、組織細胞增殖、修復(fù)重建等階段都發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［6-9］。

Jordan P等報道點陣CO2激光一次掃描可產(chǎn)生類似II度燒傷的創(chuàng)面，在Active FX模式下，點陣CO2激光穿透深度為40～200μm，當能量每增加10mJ，穿透深度增加13μm，因此需較高能量才可達真皮乳頭層；而在Deep FX模式下，點陣CO2激光穿透深度為100～1 500μm，能量每增加10mJ，穿透深度增加300μm，可穿透至真皮網(wǎng)狀層［18］?？紤]到Active FX模式的穿透深度及P物質(zhì)的表達層面，故本研究未使用點陣CO2激光Active FX模式，而只使用了Deep FX模式干預(yù)兔耳增生性瘢痕。本研究中，Deep FX模式的能量為20mJ，從圖2中可看出其穿透深度達到了相當于真皮網(wǎng)狀層的深度，即其產(chǎn)生的創(chuàng)面類似深I(lǐng)I度燒傷。本研究發(fā)現(xiàn)，點陣CO2激光治療后，P物質(zhì)表達逐漸增強，并在治療后第4天達高峰，治療后第7天P物質(zhì)表達開始減弱，并在第14天進一步減少。而陳靜等報道，深I(lǐng)I度燙傷創(chuàng)面P物質(zhì)含量在傷后7d開始增高，并持續(xù)至傷后2周，并認為這可能與創(chuàng)面真皮感覺神經(jīng)纖維遭到一定破壞，造成早期P物質(zhì)分泌不足有關(guān)，隨著神經(jīng)再生，P物質(zhì)含量逐漸增多，并在愈合期內(nèi)一直保持高水平［19］。本文與該報道的不同之處在于，本研究中P物質(zhì)表達高峰提前至治療后第4天，且隨后表達下降。

筆者所在科室在研究點陣CO2激光治療瘢痕愈合機制時發(fā)現(xiàn)，濕潤燒傷膏組治療后第4天表皮干細胞標志物K19、P63蛋白開始增多，第7天達到高峰，第14天逐漸減少［5］，而且目前已知P物質(zhì)參與了表皮干細胞的遷移、分化和調(diào)控［10-20］。因此，筆者推測，點陣CO2激光可能通過刺激P物質(zhì)釋放，從而啟動和激活了表皮干細胞，進而促進了創(chuàng)面的原位再生修復(fù)。

綜上所述，點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕后P物質(zhì)表達先升高后降低，這可能與點陣CO2激光參與創(chuàng)面再生修復(fù)有關(guān)。

［1］雷穎，譚軍，李高峰，等.超脈沖點陣CO2激光在淺表性瘢痕治療中的應(yīng)用［J］.中國美容醫(yī)學，2011，20（12）：2004-2006.

［2］譚軍，歐陽華偉，李高峰，等.點陣CO2激光結(jié)合濕性醫(yī)療技術(shù)治療增生性瘢痕的臨床效果觀察［J］.中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2011，23（5）：399-403.

［3］SasakiGH1，TravisHM，TuckerB.FractionalCO2laser resurfacingofphotoagedfacialandnon-facialskin：Histologic and clinical results and side effects［J］.J Cosmetic Laser Therapy，2009，11（4）：190-201.

［4］Cho SB，Lee SJ，Kang JM，et al.The Efficacy and Safety of 10，600-nm Carbon Dioxide Fractional Laser for Acne Scars inAsian Patients［J］.DermatolSurg，2009，35（12）：1955-1961.

［5］譚軍，雷穎，李高峰，等.超脈沖CO2點陣激光干預(yù)兔耳淺表性瘢痕的原位再生［J］.中國組織工程研究，2013，17（2）：228-234.

［6］Harrison NK，Dawes KE，Kwon OJ.Effects of neuropeptides on human lung fibroblast proliferation and chemotaxis［J］. Am J Physio1，1995，268（7）：278-283.

［7］Nilsson J，Euler AM，Dalsgaard CJ.Stimulation of connective tissue cell growth by substance P and substance K［J］.Nature，1985，315（4）：61-63.

［8］Ziche M，Morbidelli L，Pacini M.Substance P stimulates neovascularization in vivo and proliferation of cultured cells［J］.Microvase Res，1990，2：264-278.

［9］倪濤，方勇.P物質(zhì)在創(chuàng)面愈合中作用的研究進展［J］.中華燒傷雜志，2007，23（5）：395-397.

［10］黃暉，賴西南，王正國，等.感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)在表皮干細胞分化中作用的實驗研究［J］.中華燒傷雜志，2004，20（5）：295-298.

［11］李希軍，柳大烈，王吉慧，等.兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探討［J］.中國美容醫(yī)學，2006，15（5）：499-500.

［12］Morris DE，Wu L，Zhao LL，et al.Acute and chronic animalmodels for excessive dermal scarring：quantitative studies［J］.Plast Reconstr Surg，1997，100（3）：674-681.

［13］李薈元，劉建波，夏煒，等.增生性瘢痕動物實驗?zāi)Ｐ偷慕⒑蛻?yīng)用［J］.中華整形外科雜志，2001，17：276-278.

［14］湯小朋，佘銳萍，林德貴.創(chuàng)傷愈合中P物質(zhì)的免疫組化觀察［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，39（8）：12-15.

［15］仲肖靜.顏麗麗子宮內(nèi)膜腺癌中MMP-2、MMP-9表達的免疫組化研究［J］.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2014，11（9）：48-50.

［16］張楨，王青青，張根花.Musashi 1在結(jié)腸癌中的表達及其與微血管密度及預(yù)后的關(guān)系［J］.中國免疫學雜志，2015，33（1）：97-101.

［17］羅文君，陸婷婷.神經(jīng)肽P物質(zhì)與創(chuàng)傷修復(fù)的研究進展［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學，2007，34（10）：1872-1874.

［18］Farkas JP，Richardson JA，Brown SA，et al.TUNEL assay to characterizeacutehistopathologicalinjuryfollowing treatment with the active and deep FX fractional shortpulse CO2devices［J］.Aesthet Surg J，2011，31（4）：603-613.

［19］陳靜，王甲漢，莊洪興，等.神經(jīng)肽P物質(zhì)與燙傷創(chuàng)面愈合關(guān)系的實驗研究［J］.中華燒傷雜志，2005，21（2）：119-121.

［20］黃暉，賴西南.表皮干細胞分化中感覺神經(jīng)肽P物質(zhì)的調(diào)控作用機制［J］.中華燒傷雜志，2006，22（7）：554-556.

編輯/張惠娟

The change of substance P during treatment of hypertrophic scars in rabbit ear with fractional CO2laser

OUYANG Hua-wei1，TAN Jun1，LI Gao-feng1，LEI Ying1，LIU Yu2
（1.Department of Plastic&Laser Cosmetic，2.Department of Pathology，Hunan Province People's Hospital，Changsha 410013，Hunan，China）

ObjectiveTo investigate the change of substance P after fractional CO2laser on the treatment of hypertrophic scars in rabbit ear.Methods The model of hypertrophic scars in rabbit ear was established，then expression of substance P were tested by immunohistochemical after fractional CO2laser on the treatment of hypertrophic scars in rabbit ear.Results The score of substance P expression at 1st day was 1.33±0.50，the score of expression at 4th day was 7.67±1.58，xpression score at 7th day was 4.00±1.41，the score of expression at 14th day was 1.56±0.88，there is statistical significance between the two days（P＜0.05）.ConclusionsThe change of substance P after fractional CO2laser on the treatment of hypertrophic scars in rabbit ear shows a trend from rise to decline，it may be related to fractional CO2laser participating in wound regeneration in situ.

substance P；fractional CO2laser；hypertrophic scar；rabbit；model of hypertropic scar

R394 R619+.6

A

1008-6455（2015）18-0031-03

湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)基金（2011-15）資助

2015-06-06

2015-08-25