陳甫寰，宋慧鋒，岳曉彤，劉玲英，王統(tǒng)民，何秀葉

（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形五病區(qū)北京100048）

·基礎研究·

成人表皮干細胞和汗腺細胞的體外分離和培養(yǎng)

陳甫寰，宋慧鋒，岳曉彤，劉玲英，王統(tǒng)民，何秀葉

（解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院燒傷整形五病區(qū)北京100048）

背景：人表皮干細胞和汗腺細胞的分離培養(yǎng)及鑒定，為探討人表皮干細胞再生汗腺的可行性打下基礎。目的：探討體外分離培養(yǎng)人表皮干細胞及汗腺細胞的有效方法。方法：采集不同年齡段的泌尿外科患者術后包皮組織，充分清洗消毒后去除皮下組織，將其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片，用Ⅳ型膠原純化、富集成人表皮干細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)：使用免疫熒光染色對成人表皮干細胞表型進行分析；CCK-8檢測細胞的增殖曲線；采用膠原酶消化法從人全層無損傷皮膚中分離提取汗腺細胞，并進行擴增和鑒定。結果：倒置相差顯微鏡下見分離培養(yǎng)的成人表皮干細胞呈卵圓形、細胞之間緊密相連，呈鋪路石狀，免疫熒光染色顯示細胞表達CK19、β1整合素。倒置相差顯微鏡下見汗腺細胞呈扁平多角形，表達汗腺細胞標志細胞CK7、18、19及CEA。結論：本實驗結果說明膠原酶消化法分離培養(yǎng)成人表皮干細胞及汗腺樣細胞是可行的。

汗腺細胞；表皮干細胞；培養(yǎng)；分離；鑒定

干細胞及組織工程學科最近幾年的發(fā)展，為大面積燒、創(chuàng)傷患者的修復開辟了新的途徑。2006年，Moore KA和Lemischka IR等人［1］發(fā)現(xiàn)：表皮干細胞（Epidermal Stem Cells，ESCs）來源于胚胎的外胚層，是屬于皮膚的一種專能干細胞，也是一種成年組織的干細胞，其增殖和分化成表皮中各種細胞的能力維持著皮膚正常表皮結構，并且可以在一定誘導條件下表現(xiàn)出胚胎干細胞性能的雙向分化能力，是一種潛在的多能干細胞，對于組織工程學科而言是很有前景的一種細胞。

皮膚作為人體面積最大的器官，擔負著非常重要的生理功能，對于整形外科大夫而言，一個完整并且具有功能的皮膚對于維持外觀也是有著十分重要的作用。然而燒、創(chuàng)以及戰(zhàn)傷中，皮膚是首當其沖被損壞的器官。嚴重的皮膚損傷會導致皮膚附屬器損傷后再生困難，然而汗腺作為皮膚重要的附屬器官之一，對于機體有著分泌和排泄汗液，而且可調節(jié)體溫的功能；缺失汗腺等附屬器的瘢痕組織則很難完成這一任務，因而導致燒、創(chuàng)以及戰(zhàn)傷的患者生活質量嚴重下降，也伴隨著生理及心理的嚴重障礙。因此如何有效地在體外培養(yǎng)人汗腺細胞對于從細胞水平深入研究汗腺的結構和功能有著重大的意義，并且也為后期的表皮干細胞分化實驗提供實驗基礎。

研究成人表皮干細胞和汗腺細胞（Sweat Gland cells；SGCs）的體外分離培養(yǎng)和增值及鑒定，可為觀察ESCs和SGCs共培養(yǎng)前后細胞形態(tài)、細胞表型改變；探討ESCs再生SGCs的可行性提供前提條件并且打下堅實的實驗基礎。

1　材料和方法

1.1設計與取材

2014年10月-2015年3月，在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實驗室進行細胞學的體外觀察及鑒定實驗。標本選自無損傷全層成人正常皮膚及不同年齡段成人包皮，分別由解放軍總醫(yī)院第304臨床部燒傷整形五病區(qū)及泌尿外科門診提供，均取得患者知情同意。

1.2主要試劑及材料

DMEM/F12基礎培養(yǎng)基（Gibco公司），F(xiàn)BS（Gibco公司），PBS，青霉素/鏈霉素/倆性霉素B三抗（美國PAA公司）、胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）、K-SFM培養(yǎng)基，重組人表皮生長因子（rh-EGF）、Dispase酶（Gibco公司），Ⅳ型膠原（美國Sigma公司）；Ⅱ型膠原酶；β1整合素（β1-integrin）受體單克隆抗體（英國Abcam公司），CK19受體單克隆抗體，癌胚抗原（CEA）單克隆抗體，倒置顯微鏡（德國Leica公司）、離心機（日本Kubota公司）。生物凈化工作臺（北京偉達凈化研究所）。

1.3方法

1.3.1成人表皮干細胞的分離培養(yǎng)：包皮組織碘伏浸泡5～10min，酒精脫碘。紫外線滅菌工作臺上利用無菌外科手術器械去除皮下組織。將剩余組織修剪出1cm×1cm大小的皮片，Dispase酶4℃避光消化12～14h后分離表皮和真皮層，盡可能的剪碎表皮，0.125%的胰蛋白酶（內含0.04%EDTA）37℃消化10～15min。加入完全培養(yǎng)液終止消化，仔細吹打。200目篩網(wǎng)過濾。濾液通過離心機（1 300r/min離心5min），棄去上清液，收集細胞。倒置相差顯微鏡下觀察細胞，計數(shù)后決定重懸細胞的培養(yǎng)基量，加入適當K-SFM培養(yǎng)基并且緩慢吹打細胞制成單細胞懸液，接種于預先使用Ⅳ型膠原鋪板的六孔板中，恒溫箱孵育過夜，24h后換液。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3d換液，當細胞生長融合到70%時傳代。

1.3.2成人表皮干細胞鑒定：β1整合素和CK19免疫熒光染色法鑒定：將2代ESCs接種于96孔板中培育24h，用PBS洗滌細胞3次后，4%多聚甲醛固定40min，PBS清洗3次；加入0.3%Triton進行通透化處理；正常山羊血清封閉30min后，傾倒。免洗，加入稀釋后的一抗，4℃過夜。隔日使用PBS清洗后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記二抗，避光孵育30min。使用倒置熒光顯微鏡拍照記錄。

1.3.3 CCK-8檢測ESCs增殖：分離成人的ESCs，選擇生長狀態(tài)良好的ESCs；胰酶消化，離心后，棄去上清，制作細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種5×103個細胞，分別于1、2、3、4、5、6、7d相應時間點取出一個培養(yǎng)板，相應制作空白對照組，每孔加入CCK-8溶液10μl，培養(yǎng)3h后，在酶標儀上測定吸光度（A）值，根據(jù)A450nm值繪制細胞增殖曲線。

1.3.4汗腺細胞的分離培養(yǎng)：將全層無損傷正常全層皮膚，置于PBS中反復漂洗，去除皮下脂肪、血管及肌肉等組織，在25mm2培養(yǎng)皿中將皮膚剪成1mm×1mm左右的組織塊，加入內皮消化液3ml，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜（約10～12h），次日，在紫外線消毒的倒置相差顯微鏡（50×）下挑取汗腺組織，放置在PBS中清洗汗腺組織，10min后再次挑選出汗腺組織，放置在汗腺培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)。汗腺培養(yǎng)基汗腺培養(yǎng)基以DMEM/F12作為基礎培養(yǎng)液，配以體積分數(shù)10%胎牛血清、15μg/L重組人表皮生長因子、4μg/L三碘甲狀腺原氨酸、0.5mg/L半琥珀酰氫化可的松、體積分數(shù)5%胰島素轉鐵蛋白-亞硒酸鈉及100U/ml三抗。2～3d，等待汗腺組織貼壁后，補加1～1.5ml汗腺培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4d換1次培養(yǎng)基。

1.3.5去除混雜的成纖維細胞：培養(yǎng)SGCs過程中，如挑選汗腺組織的過程中PBS清洗不徹底，少量成纖維細胞混雜生長，需及時去除混雜的成纖維細胞，否則影響SGCs的生長；采用低濃度的胰蛋白酶（0.05%）消化成纖維細胞，純化汗腺細胞，步驟為：PBS洗2次，6孔板中加入2～3ml的0.05%胰蛋白酶，隨時在倒置相差顯微鏡觀察，當成纖維細胞開始收縮變圓至脫落，加入內皮完培終止消化，仔細吹打事先標記的成纖維細胞區(qū)域，PBS沖洗3次，加入1.5ml汗腺培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6汗腺細胞的免疫熒光鑒定：CK7、CK18、CK19和CEA免疫熒光染色法鑒定：將1代SGCs接種于事先放置有載玻片的6孔板中培育24h，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定40min，PBS清洗3次；0.3%Triton通透化處理；正常山羊血清封閉30min，傾倒。免洗，加入稀釋后的一抗，4℃過夜。隔日，PBS清洗后加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記二抗，避光孵育30min。倒置熒光顯微鏡拍照記錄。

1.4主要觀察指標

培養(yǎng)的ESCs和汗腺細胞的形態(tài)及鑒定結果。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS2.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)和標準差表示，樣本之間比較采用組間t檢驗，以Sig=0.000＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1A2　4h時表皮干細胞還未貼壁，呈圓盤透亮化（100×）

圖1B　3d后，表皮干細胞開始貼壁（100×）

圖1C　10d后，表皮干細胞長滿六孔板（100×）

圖1D　第5代表皮干細胞開始分化、衰老，形態(tài)相差大（200×）

2　結果

2.1分離培養(yǎng)的表皮干細胞的形態(tài)

倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，采用酶消法分離細胞，Ⅳ型膠原酶篩選法培養(yǎng)的人表皮干下細胞，培養(yǎng)24h開始貼壁（圖1A），呈卵圓形且透亮。換液后可以發(fā)現(xiàn)部分未貼壁漂浮細胞被沖洗掉，其余的細胞3d后基本全部貼壁生長（圖1B），10d左右長滿六孔板約80%（圖1C）。細胞之間連接緊密，呈鋪路石狀。繼續(xù)培養(yǎng)，克隆逐漸擴大部分中央會出現(xiàn)細胞復層生長。傳代后生長速度極為迅速，一般5d左右便可以傳代一次，到第五代時表皮干細胞開始衰老死亡（圖1D）。

圖2　表皮干細胞CCK-8增殖曲線

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

實驗組增殖曲線（圖2）近似S形。細胞接種后1～2d處于潛伏期，第3天開始進入對數(shù)增殖生長，第7天達到高峰，而第6天生長不明顯，細胞在96孔板中長滿板的速度明顯快于六孔板，第7天達到高峰。

從統(tǒng)計學角度來講，F(xiàn)統(tǒng)計量的sig0.000小于0.05，所以拒絕了方差相等的假設。t檢驗中，雙側sig值0.000小于0.05，因此，在0.05置信度水平時，可認為兩者存在顯著性差異。因此，實驗組的細胞增殖顯著高于對照組（表1、表2）。

2.3表皮干細胞免疫熒光表型結果

第三代的人表皮干細胞熒光免疫細胞化學檢測結果：β1整合素、p63和CK19強烈表達（圖3A～C）。符合表皮干細胞表面標記物，證明所分離培養(yǎng)細胞為表皮干細胞。

2.4分離培養(yǎng)汗腺細胞形態(tài)

Ⅱ型膠原酶消化剪碎的皮膚組織，可見汗腺組織游離，呈盤曲狀（圖4A），消化過度的汗腺組織則呈顆粒狀（圖4F）。細胞接種于六孔板，2～3d可見貼壁的汗腺組織，并且向外生長汗腺細胞（圖4B），培養(yǎng)汗腺細胞的期間有成纖維細胞妨礙汗腺細胞的生長（圖4C）。汗腺細胞從游離的完整汗腺組織中生長，呈多邊形，持續(xù)分裂2周，部分細胞可在后期依然保持分裂能力，在原有的細胞基礎上持續(xù)生長，可疊加生長，出現(xiàn)類似鋪路石樣改變（圖4D）。

培養(yǎng)汗腺細胞的過程中，顯微鏡下可以觀察到有轉運功能的上皮細胞在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)其特有的“Dome”結構形成［2］（圖4G），其形成可能與腺上皮液體跨膜運輸有關。培養(yǎng)4周左右，汗腺細胞顯示衰老，細胞空泡樣變并且停止繼續(xù)分裂生長（圖4E）。

2.5汗腺細胞免疫熒光結果

免疫熒光細胞化學染色法檢測可見本實驗組所培養(yǎng)的汗腺細胞強烈表達CEA，符合汗腺細胞的表面標記物，且CK7、CK18、CK19也有明顯表達（圖5A～D）。

表1　SPSS組間比較結果

表2　獨立樣本檢驗

圖3A　β-integrin（200X）

圖3B　p63（200X）

圖3C　CK19（200X）

圖4A　汗腺組織團塊（50×）

圖4B　2d后開始貼壁，SGCs向外生長（100×）

圖4C　培養(yǎng)10d后發(fā)現(xiàn)成纖維細胞混雜生長（100×）

圖4D　15后SGCs長滿六孔板（100×）

圖4E　衰老的SGCs（100×）

圖4F　消化過度的汗腺組織（100×）

圖4G　“Dome”結構（200×）

圖5A　CK7（200×）

圖5B　CK18（200×）

圖5C　CEA（200×）

圖5D　CK19（200×）

3　討論

3.1成人ESCs的分離培養(yǎng)及鑒定

培養(yǎng)成人表皮干細胞的培養(yǎng)基成分、種植細胞的密度、培養(yǎng)的溫度以及Ⅳ型膠原鋪板濃度的掌握，對于其體外增殖和分化特性可產(chǎn)生很大的影響。就ESCs而言，隨著年齡的不斷增長，人體ESCs的含量也會隨著減少，同時也會集中于表皮隆突部或者真皮乳頭頂部的基底層內，這有可能是兒童皮膚損傷修復能力強于成人的生理依據(jù)之一［3］。因此，將體內的表皮干細胞在體外條件下進行分離培養(yǎng)及鑒定，顯得十分重要。本實驗采用了胰酶消化、高濃度Ⅳ型膠原篩選法提取ESCs。傳代時所需時間減少，降低了多次離心對細胞的損傷和丟失等特點。

在表皮干細胞研究中，發(fā)現(xiàn)表皮干細胞的標記物種類非常之多，但目前應用最多的則為β1整合素、CK19、p63等［4］，ESCs的β1-整合素表達水平是短暫擴增細胞的2倍，由此判斷β1-integrin可作為ESCs的表面標記物之一［5］。ESCs表達CK19與CK15［6］，但CK15表達減少較早出現(xiàn)，因此認為CK15和CD34是毛囊干細胞的標志物［7］，毛囊根鞘膨隆凸部存在CK19陽性細胞，也是ESCs存在的部位，并且CK19陽性細胞同時高度表達α3β1整合素；這些都可以證明CK19是ESCs的另一個重要標記物。還有一種可能成為ESCs表面標記物的是p63，維持ESCs生物特性及增殖分化中起決定性的作用［8］。

3.2汗腺細胞的體外分離培養(yǎng)增殖和鑒定

以前一般采用組織塊培養(yǎng)法來取得SGCs［9］，但其生長周期較長、傳代困難并且摻雜成纖維細胞污染SGC問題嚴重。本實驗利用‖型膠原酶消化法，通過顯微鏡觀察汗腺組織，微量移液器吸取汗腺的方法來分離培養(yǎng)汗腺細胞，但仍需注意以下問題：①選擇汗腺豐富的全層無損傷正常皮膚組織如雙手、雙腳以及額部皮膚等；②皮膚漂洗的時間不宜過長，消毒液濃度不宜太高；這些都是導致汗腺質量下降的原因；③Ⅱ型膠原酶使用濃度及其消化時間：加入含有Ⅱ型膠原酶（2g/L）消化過夜，時間不宜過長，10～12h為宜；④汗腺組織貼壁時添加培養(yǎng)基量：初始汗腺培養(yǎng)基添加過少，不能提供足夠的濕度和營養(yǎng)；過多，挑取的汗腺漂浮其中無法貼壁，初始六孔板中加入600～800μl汗腺培養(yǎng)基為宜；⑤皮膚組織處理大小：皮膚離體24h內，無菌手術器械反復剪碎新鮮皮膚組織，1mm×1mm大小為宜，過大不利于汗腺游離，過小則易消化過度，導致其崩解（圖D6）；⑥隨時嚴密觀察汗腺游離情況；⑦使用微量移液器挑取汗腺時，先放入事先準備的PBS中，每挑取一個汗腺置于其中洗滌，盡可能去除混有的成纖維細胞以及多余的‖型膠原酶，然后接種于六孔板中，盡可能避免細胞污染。

目前對汗腺細胞表面標志物缺乏特異且排他性的表面標志物［10-15］。但CEA、CK19、CK18以及CK7對于汗腺細胞有著重要的意義［16-18］，因此本實驗組通過這四個標記物來證實所分離培養(yǎng)的細胞為汗腺細胞，而不是皮膚組織中的其他上皮細胞。

表皮干細胞作為皮膚組織中的專能干細胞，既可通過遷移分化成為表皮基底層，進一部生成汗腺、毛囊等皮膚附屬器官，又可通過最終分化成為各種表皮細胞［19］，適宜用作皮膚組織工程的種子細胞。表皮干細胞具有體內周期慢以保證其巨大的增殖潛能及減少DNA復制時的出錯幾率，且數(shù)量相對稀少［20］，因此體外分離培養(yǎng)表皮干細胞顯得至關重要。

干細胞壁龕學說認為：干細胞所處微環(huán)境有較好的誘導分化作用。干細胞進入某種特定的微環(huán)境后，其分化信號會有反應并且已分化細胞也會對其他未分化細胞有影響，導致其向某些特定細胞分化［21］。干細胞壁龕學說對于定義細胞種類、特定調控因子及其細胞間的作用有著開創(chuàng)性的框架作用，并且處于生理狀態(tài)下的干細胞的壁龕對于組織的損害修復，老化以及疾病的進展目前了解甚少，主要是因為體內環(huán)境的特殊性，微環(huán)境誘導的具體機制及其基因水平的調控等各方面尚不明確，多種因素都對于干細胞的分化均有可能有作用，體內微環(huán)境的改變是很難實現(xiàn)的，但體外模擬體內微環(huán)境是可行的；由此誘導干細胞體外分化的研究成為熱門。采取的方法主要有用目的細胞培養(yǎng)的上清液誘導和與目的細胞共培養(yǎng)兩種方式。因此體外分離培養(yǎng)SGCs和ESCs，誘導增殖能力強、具有多種分化能力潛能并且免疫原性低的ESCs分化為汗腺細胞等皮膚附屬器相關細胞，為建造一個理想的組織工程皮膚有著很大的幫助。

人工構建包含皮膚附屬器的組織工程皮膚是最終發(fā)展的方向，由于皮膚損傷導致的皮膚附屬器缺失的患者，生活質量嚴重下降；選擇免疫原性低且包含功能的人工皮膚對于嚴重燒、創(chuàng)以及戰(zhàn)傷的患者而言是十分重要且迫切的。因此構建可再生皮膚附屬器的種子細胞就顯得十分重要。筆者實驗組認為：ESCs可作為汗腺組織工程種子細胞的重要來源，前期的分離培養(yǎng)ESCs及SGCs為以后繼續(xù)探索和闡明ESCs向SGCs分化的機制做出有力鋪墊，也為進一步研究提供了有力條件。

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編輯/張惠娟

Isolation and culture of human epidermal stem cells and sweat gland cells in vitro

CHEN Fu-huan，SONG Hui-feng，YUE Xiao-tong，LIU Ling-ying，WANG Tong-min，HE Xiu-ye
（The Fifth Ward of Burn and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital，Beijing 100048，China）

Background Research on the culture and identification of human Epidermal Stem Cells（ESCs）and Sweat Gland Cells（SGCs）In vitro，Which can provide the foundation for the feasibility of Epidermal Stem Cells（ESCs）to regenerate Sweat Gland.Objective To study the effective method on isolation and culture of sweat gland cells（SGCS）and human Epidermal Stem Cell（ESCs）in vitro. Methods Foreskin tissue with different ages were collected by Urology Department，after being fully cleaned and disinfected，we removed the subcutaneous tissue；then We trimmed left tissue to 0.5cm× 0.5cm size；with the help ofⅣcollagen to purify and enrich adult's Epidermal stem cells（ESCs）. EpidermalStemCells'formwereobservedbyinvertedphasecontrastmicroscope: Immunofluorescence staining to analysis adult's epidermal stem cells'phenotype；CCK-8 was used to detect proliferation curve；We used collagenase digestion to isolate sweat gland from intact skin，and than amplified and identified Sweat Gland Cells（SGCs）.ResultsUsing inverted phase contrast microscope to observe isolated adult Epidermal Stem Cells，finding out that Epidermal Stem Cells were cultured like oval，and closely linked among each other，like cobblestone；Immunofluorescence stain was used to find that Epidermal Stem Cells expressed CK19，β1-integrin.We observed that Sweat Gland Cells were cultured like flat polygonal and expressing markers like CK7，CK18，CK19 and CEA.Conclusion In a word，it is feasible to separate and culture Epidermal Stem Cells with adherent method and Sweat Gland Cells with collagenase digestion method.

Sweat Gland Cells（SGCs）；Epidermal Stem Cells（ESCs）；culture；isolation；identification

Q813.1

A

1008-6455（2015）14-0036-07

國家自然科學基金資助項目（項目編號：81171821）

宋慧鋒，主任醫(yī)師；主要研究方向：美容整形、瘢痕整形以及組織工程等；E-mail:song_huifeng@126.com

2015-05-02

2015-06-29