鞠延侖，房玉林*，張莉，曾婕，劉吉彬

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100）

赤霞珠葡萄脂氧合酶活性測(cè)定及脂肪酸組分的變化

鞠延侖，房玉林*，張莉，曾婕，劉吉彬

（西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100）

以赤霞珠葡萄果實(shí)為研究材料，亞油酸鈉為底物，測(cè)定脂氧合酶活性；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)葡萄果皮中的脂肪酸組分進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在溫度為40℃，底物濃度為2×10-4mol/L，pH值為7.0時(shí)該酶活性最高，同時(shí)該酶在80℃高溫下仍表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性；在赤霞珠發(fā)育過(guò)程中該酶的活性從轉(zhuǎn)色期開(kāi)始上升，直到成熟前2～3周左右達(dá)到最大值，之后迅速下降，成熟期又趨于平穩(wěn)。赤霞珠葡萄果皮中共檢測(cè)出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸占據(jù)了飽和脂肪酸含量的大部分，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分，脂肪酸總含量在不斷增大，成熟前1周左右含量最大。

赤霞珠；脂氧合酶；脂肪酸；酶活性；組分變化

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）首次發(fā)現(xiàn)于大豆中，又稱為亞油酸氧化還原酶、脂肪氧化酶、脂肪氧合酶、脂肪加氧酶或類胡蘿卜素氧化酶。研究發(fā)現(xiàn)脂氧合酶在各種高等植物中廣泛存在，該酶是一種蛋白質(zhì)并且含有非血紅素鐵，能夠催化結(jié)構(gòu)中含有順，順-1，4-戊二烯的多元不飽和脂肪酸發(fā)生加氧反應(yīng)，大量存在于植物膜脂中的亞油酸和亞麻酸是該酶的主要底物，生成的過(guò)氧化氫物具有共軛雙鍵［1］，其能通過(guò)各種反應(yīng)生成醛、酮、脂類等具有揮發(fā)性的小分子物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)葡萄的風(fēng)味質(zhì)量有很大影響［2］。

LOX與植物的成熟、衰老密切相關(guān)，在植物受到機(jī)械傷害和病蟲(chóng)侵染時(shí)能產(chǎn)生信號(hào)分子進(jìn)行調(diào)節(jié)［3-5］；LOX與植物抗旱等抗逆性密切相關(guān)［6］；LOX酶的作用又受到脂肪酸的影響，脂肪酸組分關(guān)系到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和脂類，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的組分［7］，兩者的生理作用密切相關(guān)，共同對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到調(diào)節(jié)作用，影響葡萄果實(shí)的質(zhì)量。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，我國(guó)對(duì)優(yōu)質(zhì)葡萄酒需求持續(xù)增加。由于葡萄酒質(zhì)量和風(fēng)格主要決定于原料，因此，通過(guò)改善葡萄原料的成熟質(zhì)量，尤其是關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的含量，對(duì)于提高葡萄酒質(zhì)量和風(fēng)格具有重要的意義［8］。目前關(guān)于脂氧合酶的研究主要集中在獼猴桃、黃瓜等［9-10］植物果實(shí)中，對(duì)于葡萄果實(shí)脂氧合酶的相關(guān)研究報(bào)道很少，目前還沒(méi)有一個(gè)系統(tǒng)的測(cè)定方法。本研究采用分光光度計(jì)法［11-12］，通過(guò)研究溫度、底物濃度、pH值等因素對(duì)葡萄脂氧合酶活性的影響，進(jìn)而確定葡萄果實(shí)脂氧合酶測(cè)定的方法，為葡萄果實(shí)脂氧合酶的測(cè)定提供理論依據(jù)。同時(shí)，通過(guò)研究赤霞珠發(fā)育過(guò)程中脂氧合酶活性及脂肪酸組分的變化，為葡萄園的管理、提高葡萄原料質(zhì)量提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于陜西楊凌曹辛莊葡萄園2008年扦插定植的赤霞珠（Cabernet Sauvignon），歐亞種（Vitis vinifera L.）釀酒葡萄品種。從果實(shí)轉(zhuǎn)色后到成熟（8月16日、8月18日、8月20日、8月22日、8月24日、8月26日、8月29日、8月30日、9月1日、9月3日、9月5日、9月7日）每3d取兩次樣。取樣方法為隨機(jī)取樣：按照五點(diǎn)法，除去外周兩行，每個(gè)取樣區(qū)相對(duì)固定30株生長(zhǎng)相對(duì)中庸一致的葡萄植株，取樣保證植株陰陽(yáng)兩面隨機(jī)采取。每次取樣后，樣品于0.5h內(nèi)保存到—20℃的冰箱內(nèi)。

石油醚、乙醚、甲醇（均為色譜級(jí)）南京化學(xué)試劑公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）、吐溫-100美國(guó)Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

SiruaLLL RC-5C+冷凍高速離心機(jī)（配有SS-34鋁合金角度轉(zhuǎn)頭、SLA-1000超輕鋁合金角度轉(zhuǎn)頭及250、50、12mL離心管）、Thermo Finnigan TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（含有直接進(jìn)樣裝置、頂空進(jìn)樣器及熱脫附儀）美國(guó)科峻儀器公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、AUW220D萬(wàn)分之一天平、超聲波提取器日本島津公司。

1.3方法

1.3.1反應(yīng)底物（亞油酸鈉母液）的制備

參考Axelrod［13］、李強(qiáng)［14］、陳昆松［15］等的方法，略做修改。研究所用的酶反應(yīng)底物為10mmol/L亞油酸鈉母液、70mg亞油酸鈉固體、70μL Triton X-100和4mL無(wú)氧水，混勻（避免產(chǎn)生氣泡）后，用0.5mol/L NaOH滴定至溶液澄清，定容至25mL，分裝（1～1.5mL），-18℃保存?zhèn)溆?。操作過(guò)程避光。

1.3.2提取緩沖液的制備

取1mL Triton X-100和4g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP），加入到100mL0.1mol/L pH6.8的磷酸緩沖液中，搖勻，置于4℃的冰箱中預(yù)冷。

1.3.3粗酶液的提取

參考陳昆松等［15］的方法，略微改動(dòng)。取不同時(shí)期的葡萄樣品，分別剝?nèi)?g葡萄皮置于研缽內(nèi)，在液氮下研磨，分別加入5mL經(jīng)4℃預(yù)冷的提取緩沖液，4℃、12000r/min離心30min，收集上清液，得粗酶液，編號(hào)儲(chǔ)存，用于LOX活性測(cè)定。

1.3.4酶活性的測(cè)定

參考Axelrod［13］、李強(qiáng)［14］、李銘韌［16］等的方法，略做改動(dòng)。反應(yīng)體系中含亞油酸鈉母液25μL、磷酸緩沖液2900μL、粗酶液75μL，反應(yīng)溫度25℃，于234nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。加酶液后30s開(kāi)始計(jì)時(shí)，記錄120s（每隔15s測(cè)一次）內(nèi)光密度值變化。用磷酸緩沖液作為空白對(duì)照，重復(fù)3次。酶活力單位定義為每克樣品每分鐘光密度變化值增加0.01為1個(gè)LOX酶活力單位（U）。

1.3.5赤霞珠葡萄LOX酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定

將空試管置于一定溫度（20、25、30、35、40、45、50、55、60℃）的水浴中，于試管中依次加入粗酶液75μL、磷酸鹽緩沖液（pH6.8，0.1mol/L）2900μL、亞油酸鈉母液25μL。加入底物后立刻準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)120s后立即加入4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到3.0，此時(shí)終止反應(yīng)，在234nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值?？瞻讓?duì)照為在加入粗酶液75μL后，先加入鹽酸，再先后加入等量緩沖液和底物，反應(yīng)120s。

1.3.6赤霞珠葡萄LOX酶反應(yīng)最適底物濃度的測(cè)定

在室溫（25℃），pH6.8的磷酸緩沖液條件下，改變底物的濃度，測(cè)定LOX酶的活性。測(cè)定體系同1.3.4節(jié)，在3mL反應(yīng)體系中加入底物（亞油酸鈉母液）的量分別為0.83×10-4、1.67×10-4、2.0×10-4、2.33×10-4、2.67×10-4、3.33×10-4、5.0×10-4mol/L，然后再通過(guò)改變所加緩沖液的體積來(lái)保證3mL反應(yīng)體系保持不變。

1.3.7赤霞珠葡萄LOX酶反應(yīng)最適pH值的測(cè)定

室溫條件下，改變緩沖液pH值（磷酸緩沖液pH6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0，硼酸-硼砂緩沖液pH7.4、7.6、7.8、8.0，濃度均為0.1mol/L），測(cè)定LOX酶的活性，測(cè)定體系同1.3.4節(jié)。

1.3.8赤霞珠葡萄LOX酶熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在緩沖液pH值為6.8的條件下，不同溫度（20、30、40、50、60、70、80、90℃）處理LOX粗酶液1h，然后將粗酶液放到冰上冷卻，在室溫條件下測(cè)定處理后LOX酶的活性。

1.3.9赤霞珠葡萄發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性的變化

取2900μL0.1mol/L pH6.8磷酸緩沖液，加入25μL底物，在25℃中保溫10min，再加入不同時(shí)期的粗酶提取液75μL，混勻，30s后開(kāi)始計(jì)時(shí)，在234nm波長(zhǎng)處記錄120s（每隔15s測(cè)一次）內(nèi)的光密度值，重復(fù)3次。測(cè)定LOX酶活性。

1.3.10脂肪酸的提取

［17-19］的研究方法，略微改動(dòng)。取葡萄皮5g在液氮下充分研磨，加入10mL石油醚-乙醚（4∶3，V/V）混合液于0～4℃條件下提取24h。然后加入0.4mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液10mL，在室溫條件下甲酯化2h，4000r/min室溫離心10min，取上層有機(jī)相，置于10mL蒸餾燒瓶中，減壓蒸餾，定容至5mL。取1mL樣品于進(jìn)樣瓶中，并加入質(zhì)量濃度為100mg/mL的十七烷酸甲酯1μL作為內(nèi)標(biāo)物。待用。

1.3.11色譜條件

參考文獻(xiàn)［20-21］設(shè)置色譜條件：DB5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25μm）；進(jìn)樣1μL；分流進(jìn)樣（分流比30∶l）；進(jìn)樣口溫度240℃；檢測(cè)器溫度250℃；升溫程序；100℃保持1min，以8℃/min的速率升至205℃，保留0.l min，再以3℃/min的速率升至240℃，保留10min；載氣壓力（N2）0.60kg/cm2，燃?xì)鈮毫Γ℉2）0.65kg/cm2，助燃?xì)鈮毫Γ諝猓?.50kg/cm2。

1.3.12質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度250℃；激活電壓1.5V；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～500。

2　結(jié)果與分析

2.1赤霞珠葡萄LOX酶最適反應(yīng)溫度

圖1　不同溫度對(duì)赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.1Effect of temperature on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖1可知，當(dāng)溫度低于40℃時(shí)，LOX酶的活性隨著溫度升高有所增加，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，LOX酶的活性達(dá)到最高，之后LOX酶活性隨溫度的升高開(kāi)始迅速下降，溫度超過(guò)45℃時(shí)酶活性比20℃時(shí)的活性更低。其他果實(shí)研究發(fā)現(xiàn)：黃瓜果實(shí)LOX酶在40℃時(shí)有很高活性［14］，牡丹花瓣LOX酶在45℃時(shí)有很高活性［16］，與本研究結(jié)果基本一致。

2.2赤霞珠葡萄LOX酶的最適底物濃度

圖2不同底物濃度對(duì)赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.2Effect of substrate concentration on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖2可知，底物濃度小于2×10-4mol/L時(shí)，酶活性隨著底物濃度增加而不斷增大，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?/p>

2×10-4mol/L時(shí)LOX酶活性達(dá)到最高，之后隨著底物濃度增大，酶活性減小。這可能是由于體系中添加的亞油酸量過(guò)多，亞油酸發(fā)生自氧化，有羥基過(guò)氧化物的生成，而當(dāng)體系中含有過(guò)多的羥基過(guò)氧化物時(shí)便會(huì)引起

LOX酶失活［5］。

2.3赤霞珠葡萄LOX酶的最適反應(yīng)pH值

圖3不同pH值對(duì)赤霞珠葡萄LOX酶活性的影響Fig.3Effect of pH on LOX activity in Cabernet Sauvignon grapes

由圖3可知，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，LOX酶活性最高，同時(shí)，當(dāng)pH值在6.2左右時(shí)，酶活性也較高，有研究表明來(lái)源于黃瓜的LOX酶在pH7.0和pH9.0有兩個(gè)峰［14］，來(lái)源于牡丹花瓣的LOX酶在pH4.5和pH6.0有兩個(gè)峰［16］，來(lái)源于水稻的LOX酶在pH7.6和pH8.4有兩個(gè)峰［22］。植物L(fēng)OX酶大都在酸性范圍內(nèi)有最高活性，如獼猴桃為5.0～5.5，桃為6.0和4.5，牡丹花瓣為4.5［15-16，23］。出現(xiàn)兩個(gè)峰的原因可能是LOX酶含有兩種同工酶，這兩種同工酶分別有不同的最適pH值［5］。

2.4赤霞珠葡萄LOX酶的熱穩(wěn)定性研究

由圖4可知，當(dāng)處理溫度低于70℃時(shí)，LOX酶仍有很高活性，當(dāng)處理溫度達(dá)到80℃時(shí)，酶活性雖然很小，但仍有活性，表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性。這與李強(qiáng)［14］、李銘韌［16］等研究的黃瓜果實(shí)、牡丹花瓣LOX酶有很好的熱穩(wěn)定性結(jié)論一致。李強(qiáng)等［14］對(duì)黃瓜果實(shí)LOX酶的研究表明，在20～70℃范圍內(nèi)其活性隨處理溫度升高而緩慢升高，李銘韌等［16］對(duì)牡丹花瓣LOX酶的研究表明其活性在30～50℃和60～80℃內(nèi)會(huì)隨處理溫度升高而升高，但是本研究中葡萄LOX酶活性此現(xiàn)象不是很明顯。

圖4赤霞珠葡萄LOX酶熱穩(wěn)定性Fig.4Thermal stability of lipoxigenase in Cabernet Sauvignon grapes

2.5赤霞珠葡萄發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性的變化

圖5赤霞珠葡萄發(fā)育過(guò)程中LOX活性的變化Fig.5Change in LOX activity during the development process of Cabernet Sauvignon grapes

由圖5可知，赤霞珠葡萄在發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性開(kāi)始略有增加之后呈下降趨勢(shì)，到成熟期基本趨于平穩(wěn)。由于實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間較晚，使得LOX酶活性增加趨勢(shì)不夠明顯。由于LOX酶有很多對(duì)植株有利的生理功能［1，4，24］，研究葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性的變化，對(duì)于研究葡萄植株的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、抗逆性等有很大幫助，可為葡萄園的管理提供理論支持，提供高質(zhì)量的葡萄原料，有利于提高葡萄酒質(zhì)量。

2.6脂肪酸組分的變化

由表1可知，赤霞珠葡萄皮中共檢測(cè)出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸含量在飽和脂肪酸含量中所占比例較大，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分。由表2可知，隨著果實(shí)的不斷成熟，果實(shí)中的脂肪酸總量開(kāi)始不斷增加，到完全成熟前1周達(dá)到最大值，之后又下降。

表1　赤霞珠葡萄果皮中脂肪酸（甲酯）的組成Table1Fatty acid composition of grape skins kins

表2葡萄果實(shí)不同采收時(shí)期脂肪酸含量的變化Table2Change in fatty acids during different development periods of grapes pes mg/kg

3　結(jié)論與討論

研究了不同反應(yīng)溫度、底物濃度、pH值對(duì)赤霞珠果實(shí)中脂氧合酶活性的影響，確立葡萄漿果中脂氧合酶活性的測(cè)定方法；研究了赤霞珠葡萄發(fā)育過(guò)程中脂氧合酶及脂肪酸組分的變化。本研究結(jié)果證明，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時(shí)，葡萄LOX酶有很高活性；該酶表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。在其他植物L(fēng)OX酶反應(yīng)溫度的研究中發(fā)現(xiàn)LOX酶也有很好的熱穩(wěn)定性［14，16］。

隨著底物添加量增大，底物濃度增大，LOX酶的活性也不斷增大，到底物濃度為2×10-4mol/L時(shí)活性達(dá)到最大，底物濃度大于2×10-4mol/L時(shí)，酶活性不再增大，反而降低，這是由底物自身氧化產(chǎn)生的羥基過(guò)氧化物導(dǎo)致LOX酶失活引起的［5］。

當(dāng)pH值為7.0時(shí)，LOX酶活性最高，同時(shí)，當(dāng)pH值在6.2左右時(shí)，酶活性也有一個(gè)相對(duì)最高值，表明葡萄LOX酶可能含有兩種同工酶［5］。在其他植物L(fēng)OX酶最適pH值的研究中也有兩個(gè)峰值的現(xiàn)象，本研究結(jié)果與此吻合［5，14-15］。

在發(fā)育過(guò)程中赤霞珠葡萄LOX酶活性先增大后減小，成熟期趨于穩(wěn)定，這可能與脂氧合酶的生理作用有關(guān)，在發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性與外界的環(huán)境緊密相關(guān)［5］。脂肪酸總量先增加到成熟前1周達(dá)到最大含量，之后又有所下降；赤霞珠葡萄皮中檢測(cè)出13種脂肪酸，其中棕櫚酸和硬脂酸占據(jù)了飽和脂肪酸含量的大部分，油酸、亞油酸和亞麻酸是不飽和脂肪酸的主要組分，這與梁茂雨［19］、李浡［25］等的研究結(jié)果基本一致。果實(shí)中脂氧合酶活性及脂肪酸的含量變化與其生理功能密切相關(guān)，研究為提高原料質(zhì)量提供理論依據(jù)。

LOX酶是葡萄果實(shí)脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，使脂肪酸代謝產(chǎn)生具有共軛雙鍵的過(guò)氧化氫物，最終生成茉莉酸進(jìn)而增強(qiáng)植株的抗性［5］，同時(shí)脂肪酸作為細(xì)胞膜的組成部分又潛在影響著LOX酶的活性。本研究測(cè)定了赤霞珠發(fā)育過(guò)程中LOX酶活性及脂肪酸組分的變化，分析了赤霞珠發(fā)育過(guò)程中LOX酶的變化規(guī)律，脂肪酸組分的變化及其主要成分，結(jié)合LOX酶和脂肪酸在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生理學(xué)功能及相互作用，從而為葡萄園的管理提供理論支持，提供高質(zhì)量的釀酒原料，對(duì)現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)有重要意義。

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Determination of Lipoxygenase Activity and Change in Fatty Acid Composition in Cabernet Sauvignon Grape Berries

JU Yanlun，F(xiàn)ANG Yulin*，ZHANG Li，ZENG Jie，LIU Jibin
（Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture，College of Enology，Northwest A&F University，Yangling712100，China）

In this work，a spectrophotometric assay was used to investigate the lipoxygenase activity in Cabernet Sauvignon grapes using linoleic acid sodium as a substrate as a function of reaction temperature，substrate concentration and pH.Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）was used to analyze the fatty acid composition in grape skin.The changes in lipoxygenase activity and fatty acid composition in Cabernet Sauvignon during grape berry development were examined.The enzyme had the highest activity under the reaction conditions：40℃，a substrate concentration of2×10-4mol/L，and pH7.0.The enzyme activity also showed good thermal stability at80℃.At the veraison stage，the enzyme activity began to increase，and reached the maximum level at2-3weeks before maturity followed by a sharp decrease and then stabilization during the ripening stage.Thirteen kinds of fatty acids were detected in Cabernet Sauvignon grape skins.Palmitic acid and stearic acid dominated the identified saturated fatty acids；the predominant unsaturated fatty acids were oleic acid，linoleic acid and linolenic acid.The total fatty acid content reached the maximum at about1week before maturity.

Cabernet Sauvignon；lipoxygenase（LOX）；fatty acid；enzyme activity；composition change

TS255.2

A

1002-6630（2015）05-0115-05

10.7506/spkx1002-6630-201505022

2014-05-02

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目（2014K30902140）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B07）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（nycytx-30-2p-04）

鞠延侖（1990—），男，碩士研究生，主要從事葡萄生理生化研究。E-mail：1169679203@qq.com

房玉林（1973—），男，教授，博士，主要從事葡萄生理生化與葡萄資源綜合利用研究。E-mail：fangyulin@nwsuaf.edu.cn