林洪，李萌，王靜雪*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

沙門氏菌噬菌體STP4-a重組內(nèi)溶素抑菌特性分析

林洪，李萌，王靜雪*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

為研究?jī)?nèi)溶素重組蛋白LysSTP4對(duì)沙門氏菌的抑菌性能，采用擴(kuò)散法和濁度法探討不同pH值、溫度、離子強(qiáng)度等條件對(duì)其裂解穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，LysSTP4在pH 5～10和溫度30～50 ℃的條件下均能保持較高的活性，在-80 ℃條件下保存6 個(gè)月仍有85%的殘留酶活力，與膜通透劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）協(xié)同作用能夠有效抑制高濃度沙門氏菌的生長(zhǎng)。

沙門氏菌；烈性噬菌體；內(nèi)溶素

沙門氏菌為革蘭氏陰性直桿菌，是一種重要的人畜共患病原菌。在國(guó)內(nèi)外，由沙門氏菌引起的食源性疾病發(fā)生率一直位于前列[1]。隨著抗生素的大量和長(zhǎng)期使用，越來越多的沙門氏菌產(chǎn)生了耐藥性[2-3]。Pan Zhiming等[4]對(duì)我國(guó)境內(nèi)1962—2007年中分離得到的Salmonella Pullorum進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)39%～95%的細(xì)菌對(duì)氯霉素、甲氧芐啶、氨芐青霉素等常用來治療沙門氏菌感染的首選藥物具有耐藥性，超過56%的細(xì)菌具有多重耐藥性，而且在1970—1979年和2000—2007年中有明顯的耐藥性增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，研究能夠用于替代化學(xué)抗生素進(jìn)行有效沙門氏菌防治的生物綠色抑菌劑具有非常重大的意義。

噬菌體內(nèi)溶素是一類能夠裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的裂解酶[5]。盡管在1957年噬菌體內(nèi)溶素裂解細(xì)菌的能力就被首次報(bào)道，但直到2001年Nelson等[6]才證實(shí)純化的重組內(nèi)溶素可以作為抗菌劑有效控制大鼠感染A族鏈球菌（group A streptococci）。到目前為止，內(nèi)溶素已被用來防控和檢測(cè)食品中的食源性致病菌如金黃色葡萄球菌、李斯特菌和梭狀芽孢桿菌[7-9]。另有研究指出與使用小分子抗生素或噬菌體顆粒用于抗菌治療或預(yù)防相比，專一性的噬菌體內(nèi)溶素不易導(dǎo)致抗性菌株的快速出現(xiàn)[10]。隨著克隆表達(dá)技術(shù)的成熟，國(guó)內(nèi)外關(guān)于重組內(nèi)溶素的報(bào)道越來越多，這些研究結(jié)果表明內(nèi)溶素重組蛋白易于生產(chǎn)、易于工程改造并且仍具有一定的裂解專一性[11-16]。因此，內(nèi)溶素作為新型抗菌劑具有一定的優(yōu)勢(shì)。

在前期的工作中，本實(shí)驗(yàn)室分離得到一株新型廣譜的T4型沙門氏菌噬菌體STP4-a，通過對(duì)STP4-a全基因組測(cè)序和分析得知gp193編碼的蛋白為糖苷酶類型的內(nèi)溶素，通過克隆表達(dá)純化，獲得內(nèi)溶素重組蛋白。在本實(shí)驗(yàn)中將分析該內(nèi)溶素的裂解性能，為沙門氏菌噬菌體內(nèi)溶素及其他革蘭氏陰性噬菌體內(nèi)溶素的研究提供有效數(shù)據(jù)，并在利用內(nèi)溶素抑菌研究方面提供有效信息。

1　材料與方法

1.1菌株與噬菌體

宿主細(xì)菌為本實(shí)驗(yàn)室購買保存的鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028，噬菌體為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的烈性沙門氏菌噬菌體STP4-a，保藏號(hào)為CCTCC M 2014145，含有內(nèi)溶素基因的重組大腸細(xì)菌BL21（LysSTP4）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2培養(yǎng)基

LB肉湯、LB瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。液體、固體培養(yǎng)基均由成品制劑與蒸餾水按規(guī)定比例配制而成。

1.3儀器與設(shè)備

HZQ-F100型振蕩培養(yǎng)箱哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Sigma 3K15型高速冷凍離心機(jī)曦瑪離心機(jī)（上海）有限公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋日本Sanyo公司；Power Wave XS型酶標(biāo)儀美國(guó)Biotek公司。

1.4方法

1.4.1重組蛋白LysSTP4的制備

取工程菌BL21（LysSTP4）單菌落加入到10 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過夜，次日，按照1∶100的比例將菌液加入到新鮮的900 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃培養(yǎng)3 h，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）（至終濃度為1 mmol/L），在37 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，150 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后，于4 ℃、3 381×g條件下離心15 min獲得細(xì)胞。每300 mL菌液所得的細(xì)胞沉淀懸于30 mL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl，含300 mmol/L NaCl），充分混勻后，用超聲波破碎儀進(jìn)行破碎，條件為300 W、工作5 s、間隙15 s，工作次數(shù)99 次。于4 ℃、7 607×g條件下離心30 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清過0.45 μm無菌濾膜，獲得粗酶液，保存在4 ℃條件下。將4 mL Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料裝入空柱內(nèi)，先后以1 mL/min的流速用純水和結(jié)合緩沖液平衡柱子，然后加入25 mL的粗酶液，用低咪唑濃度結(jié)合緩沖液（含20 mmol/L咪唑的結(jié)合緩沖液）沖洗柱子洗脫雜蛋白，6 倍柱體積的高咪唑濃度洗脫緩沖液（含100 mmol/L咪唑的結(jié)合緩沖液）洗脫目的蛋白，并按照一個(gè)柱體積每管收集流出液，收集6 管，收集其中OD280nm值較高的4 管溶液，利用3 kD超濾離心管進(jìn)行脫鹽處理獲得純度較高的重組蛋白，并利用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將重組蛋白置于-80 ℃條件下保存，使用前置于4 ℃條件下復(fù)溶。

1.4.2LysSTP4對(duì)細(xì)菌的裂解活性測(cè)定

在前期工作中，經(jīng)克隆表達(dá)純化獲得的重組蛋白LysSTP4純度高，質(zhì)量濃度為400 μg/mL，利用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液稀釋至100 μg/mL進(jìn)行裂解活性的測(cè)定。參考Turner等[17]的方法稍作修改，采用平板擴(kuò)散法鑒定LysSTP4是否對(duì)細(xì)菌有裂解活性。取10 mL含1.5%瓊脂的培養(yǎng)基平鋪在平板中作為底層瓊脂，待瓊脂凝固后，在其上放置直徑為9 mm的牛津杯，另取10 mL含1.5%瓊脂的培養(yǎng)基，加以400 μL的經(jīng)高壓滅菌致死的對(duì)數(shù)期沙門氏菌細(xì)菌，倒入平板中，待瓊脂凝固后，取出牛津杯，小孔中加入12.5 μL 100 μg/mL的LysSTP4，將平板放置于4 ℃擴(kuò)散1 h后于37 ℃過夜溫育，觀察小孔周圍裂解圈。等量的pH 8.0 Tris-HCl緩沖液和100 μg/mL溶菌酶分別作為陰性和陽性對(duì)照組，以相同的條件測(cè)定對(duì)死亡沙門氏菌細(xì)胞壁的裂解效果。

1.4.3濁度法測(cè)定LysSTP4裂解穩(wěn)定性

參考Mikoulinskaia等[18]的方法，挑取沙門氏菌單菌落至300 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，過夜培養(yǎng)，菌液中加入終質(zhì)量濃度為5 g/100 mL的氯仿，室溫靜置15 min，7 607×g、4 ℃條件下離心10 min，沉淀用無菌純水洗滌、復(fù)溶、再次離心，重復(fù)兩次后獲得細(xì)菌沉淀，置于-80 ℃保存。

裂解活性通過OD450nm降低幅度間接表示[19]。在96 孔板中加入150 μL待測(cè)溶液，在37 ℃條件下測(cè)定OD450nm值。以不含內(nèi)溶素的溶液作為空白對(duì)照，每組3 組平行。在37 ℃條件下10 min內(nèi)OD450nm下降0.01的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.4.3.1重組蛋白LysSTP4的pH值穩(wěn)定性測(cè)定

將細(xì)菌沉淀分別用20 mmol/L的三氟乙酸（pH 2.0），20 mmol/L的檸檬酸鈉（pH 3.0、pH 4.0），20 mmol/L的丙二酸鈉（pH 5.0、pH 6.0），20 mmol/L的Bris-Tris（pH 7.0），20 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0），20 mmol/L的甘氨酸（pH 9.0、pH 10.0）復(fù)溶，獲得不同pH值的細(xì)菌懸浮液，將100 μL重組蛋白LysSTP4溶液加入到900 μL 細(xì)菌復(fù)溶液中，利用濁度法測(cè)定不同pH值條件下的OD450nm值并按照公式（1）計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.4.3.2重組蛋白LysSTP4溫度穩(wěn)定性測(cè)定

LysSTP4蛋白溶液分裝至EP管中，分別放入30、37、45、50、55、65、75 ℃水浴鍋中恒溫處理，在0、15、30 min時(shí)，分別取100 μL與利用50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl（含0.1% Triton X-100）復(fù)溶的900 μL細(xì)菌沉淀復(fù)溶液混合均勻，測(cè)定不同溫度條件下的酶活力，并按照公式（2）計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.4.3.3重組蛋白LysSTP4離子強(qiáng)度穩(wěn)定性測(cè)定

將細(xì)菌沉淀用50 mmol/L pH 8.0含0.1% Triton X-100的Tris-HCl復(fù)溶后分裝至EP管中，將100 mmol/L ZnCl2、CaCl2、MgCl2和FeSO4溶液分別加入到細(xì)菌溶液中，使其終濃度分別為0、0.1、1、10 mmol/L，混勻。100 μL重組蛋白LysSTP4溶液加入到含不同離子濃度的900 μL細(xì)菌復(fù)溶液中，測(cè)定酶活力，并按照公式（3）計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.4.3.4重組蛋白LysSTP4保存穩(wěn)定性測(cè)定

將LysSTP4保存在-80 ℃條件下，測(cè)定保存0、3、6 個(gè)月的酶活力。按照公式（4）計(jì)算殘留酶活力。

1.4.4膜通透劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）對(duì)重組蛋白LysSTP4裂解效果的影響

挑取沙門氏菌單菌落至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，過夜培養(yǎng)，菌液離心后，菌體沉淀用pH 8.0 Tris-HCl緩沖液復(fù)溶至細(xì)菌數(shù)量在107CFU/mL左右，將100 μL重組蛋白LysSTP4和100 μL 0.01 mol/L的EDTA溶液加入到800 μL 細(xì)菌復(fù)溶液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，0、30、60、120 min時(shí)刻，取混合液經(jīng)無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后，平板涂布法測(cè)定菌落數(shù)。同時(shí)，為測(cè)定單獨(dú)EDTA或內(nèi)溶素對(duì)細(xì)菌的裂解效果，將100 μL EDTA溶液和LysSTP4分別同等體積的Tris-HCl緩沖液混合，加入到800 μL細(xì)菌復(fù)溶液中，相同培養(yǎng)條件下，測(cè)定菌落數(shù)目變化。

1.5數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1重組蛋白LysSTP4對(duì)細(xì)菌的裂解活性

圖1　LysSTP4裂解活性Fig.1Lysis activity of LysSTP4

將沙門氏菌經(jīng)過高壓滅菌處理后，利用LysSTP4作用于細(xì)菌，平板擴(kuò)散法結(jié)果如圖1所示，同等質(zhì)量濃度的重組蛋白和溶菌酶都能夠形成透明裂解圈，而陰性對(duì)照的Tris-HCl緩沖液無透明圓圈形成。表明重組的融合蛋白具有裂解活性，但與同等質(zhì)量濃度的溶菌酶相比，活力要低。

2.2重組蛋白LysSTP4的pH值穩(wěn)定性

圖2pH值對(duì)LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.2Effect of pH on the lytic activity of LysSTP4

pH 10條件下酶活力達(dá)到最高值，約為590 U/mL，因此將該條件下的酶活力作為基準(zhǔn)比較其他pH值條件下的相對(duì)酶活力。由圖2可知，在pH 6～8條件下，各組之間的酶活力沒有顯著的差異（P＞0.05），約為最高酶活力的80%；而LysSTP4在pH＜5的酸性條件下，相對(duì)酶活力僅為最高酶活力的20%左右。從裂解活力上可以得知LysSTP4為一種嗜堿性裂解酶，與蠟樣芽孢桿菌噬菌體B4的內(nèi)溶素重組蛋白LysB4（pH 8.0～10.0條件下有較高的酶活力）和蠟樣芽孢桿菌噬菌體BPS13內(nèi)溶素

LysBPS13（pH 7.5～10.5范圍均有較高的酶活力）較為

一致[11,20]。

2.3重組蛋白LysSTP4的溫度穩(wěn)定性

圖3溫度對(duì)LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.3Effect of temperature on the lytic activity of LysSTP4

重組蛋白LysSTP4在4 ℃條件復(fù)溶且未經(jīng)溫水浴處理時(shí)，酶活力最高，約為360 U/mL。由圖3可知，經(jīng)30、37 ℃處理30 min內(nèi)酶活力沒有顯著變化；而在45、50 ℃條件下處理30 min后，酶活力顯著降低，相對(duì)酶活力約為60%；在55 ℃條件下，相對(duì)酶活力僅約為30%；隨著溫度的升高，相對(duì)酶活力顯著性下降，在65、75 ℃條件下處理30 min后，幾乎無裂解效果。這說明該內(nèi)溶素高溫耐受力較弱，這也與沙門氏菌噬菌體SPN1S內(nèi)溶素重組蛋白（溫度范圍25～45 ℃）較為相似[14]。

2.4重組蛋白LysSTP4的金屬離子穩(wěn)定性

圖4離子強(qiáng)度對(duì)LysSTP4裂解沙門氏菌活力的影響Fig.4Effect of iron concentration on the lytic activity of LysSTP4

由圖4可知，Zn2+對(duì)LysSTP4的裂解活性有顯著的抑制效果（P＜0.05）；低濃度的Fe2+能夠提高裂解活性，但隨著濃度的升高，反而對(duì)酶活性產(chǎn)生了抑制效果；低濃度的Ca2+對(duì)酶沒有顯著的激活或抑制作用，但高濃度的

Ca2+對(duì)內(nèi)溶素具有顯著的抑制效果（P＜0.05）；低濃度的Mg2+能夠顯著提高酶的活性，但是隨著Mg2+濃度的升高，酶活力沒有顯著的變化。

2.5重組蛋白LysSTP4的保存穩(wěn)定性

圖5LysSTP4在-80℃保存條件下的殘留酶活力Fig.5Effect of preservation duration on the lytic activity of LysSTP4

將制備的重組蛋白放置于-80℃條件下保存，保存穩(wěn)定性如圖5所示，在低溫冷凍保存條件下，雖然LysSTP4的酶活力有顯著降低（P＜0.05），但在6 個(gè)月后仍有高于85%的殘留酶活力，說明該內(nèi)溶素在低溫條件下保存不易失活，能夠長(zhǎng)期保存，這也利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和應(yīng)用。

2.6膜通透劑EDTA與重組蛋白LysSTP4聯(lián)用裂解活細(xì)菌

由圖6可知，內(nèi)溶素LysSTP4單獨(dú)作用于沙門氏菌時(shí)，在初始60 min內(nèi)有顯著性的抑菌效果（P＜0.05），但繼續(xù)培育，沙門氏菌的數(shù)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，沒有明顯的抑菌效果（P＞0.05）；單獨(dú)使用EDTA對(duì)沙門氏菌有抑菌效果，120 min后，細(xì)菌數(shù)量由3.4×107CFU/mL降低了38.8%；EDTA和內(nèi)溶素聯(lián)用對(duì)沙門氏菌有顯著性的抑菌作用，并隨時(shí)間的增加，抑菌效果更加顯著，120 min后，能將3.6×107CFU/mL的細(xì)菌有效降低約65.2%，比EDTA單獨(dú)作用時(shí)裂解效果提高了約1倍。研究結(jié)果表明，在EDTA的協(xié)同作用下，內(nèi)溶素LysSTP4能夠有效地殺滅沙門氏菌。后續(xù)研究中可以通過提高LysSTP4的蛋白質(zhì)含量或改變膜通透劑用量來改善內(nèi)溶素的抑菌效果。

圖6LysSTP4與EDTA聯(lián)用對(duì)細(xì)菌的裂解活性影響Fig.6Lysis activity of LysSTP4for the cells treated by EDTA

由于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁外側(cè)有一層較厚的外膜，阻礙了內(nèi)溶素作用于細(xì)胞壁肽聚糖層。因此，重組內(nèi)溶素單獨(dú)作用革蘭氏陰性細(xì)菌時(shí)經(jīng)常無效[21]。國(guó)內(nèi)外研究?jī)?nèi)溶素對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的作用效果時(shí)，通常采用外膜通透劑與內(nèi)溶素聯(lián)用策略[22-23]。外膜通透劑按照它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為兩類，一類為多肽類抗生素，如多黏菌素和其衍生物、聚賴氨酸和氨基糖苷類抗生素，該類物質(zhì)具有表面活性，含有帶陽電荷的游離氨基，能與磷脂中帶陰電荷的磷酸根結(jié)合，使細(xì)菌外膜通透性增加。第二類膜通透劑是以最為常用的EDTA為代表的螯合劑，EDTA能夠螯合吸附二價(jià)離子，破壞外膜穩(wěn)定性[24]。Briers等[25]將10 mmol/L EDTA與250 μg/mL綠膿假單胞菌噬菌體內(nèi)溶素協(xié)同作用，結(jié)果表明，兩者能夠?qū)?06CFU/mL綠膿假單胞菌降低4（lg（CFU/mL））。Lim等[14]將10 mmol/L EDTA與300 μg/mL內(nèi)溶素聯(lián)用在2 h內(nèi)將沙門氏菌的菌落數(shù)目由106CFU/mL有效降低至103CFU/mL。

3　結(jié)3 論

目前為止，內(nèi)溶素的應(yīng)用主要集中在革蘭氏陽性細(xì)菌的防治和檢測(cè)中，革蘭氏陰性細(xì)菌相關(guān)的內(nèi)溶素研究報(bào)道較少，尤其沙門氏菌噬菌體內(nèi)溶素的研究在國(guó)內(nèi)是空白狀態(tài)。通過測(cè)定LysSTP4對(duì)沙門氏菌的裂解效果，得知該沙門氏菌噬菌體內(nèi)溶素LysSTP4具有生物活性，這也是國(guó)內(nèi)外首例T4型沙門氏菌噬菌體內(nèi)溶素克隆表達(dá)成功。LysSTP4是一種嗜堿性蛋白，在50 ℃條件下30 min仍能保持約60%的活力，并且能夠在-80 ℃長(zhǎng)期保存，與膜通透劑EDTA協(xié)同作用能夠有效殺滅沙門氏菌。這些特性表明，LysSTP4內(nèi)溶素具有成為新型抗菌物質(zhì)的潛力。這些研究結(jié)果也為利用內(nèi)溶素防控耐藥性沙門氏菌提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

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Characterization of Recombinant Endolysin from a Salmonella-Infecting Bacteriophage STP4-a

LIN Hong，LI Meng，WANG Jingxue*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao266003，China）

In the present study, the recombinant endolysin from Salmonella-infecting bacteriophase STP4-a was characterized for its biochemical properties such as pH, temperature and iron concentration by the plate diffusion a n d turbidity methods. The results showed that the endolysin was stable over broad pH and temperature ranges and was active from pH 5.0 to 10 and from 30 to 50 ℃. After 6 months of storage at - 80 ℃, the activity of endolysin retained 85% of the original level. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used to increase outer membrane permeability, and it greatly enhanced the lytic activity of STP4-a endolysin.

Salmonella; lytic bacteriophage; endolysin

TS254.5

A

1002-6630（2015）05-0104-05

10.7506/spkx1002-6630-201505020

2014-05-07

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD28B05）

林洪（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制技術(shù)。E-mail：linhong@ouc.edu.cn

王靜雪（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：snow@ouc.eud.cn