張穎，曾艷，張麗姣，崔世茂，孫媛霞，*

（1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古呼和浩特010010；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308）

不同食用菌菌糠多糖的組分分析與抗氧化活性評價

張穎1，曾艷2，張麗姣2，崔世茂1，孫媛霞2，*

（1.內蒙古農業(yè)大學農學院，內蒙古呼和浩特010010；2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津300308）

目的：比較茶樹菇、香菇、白玉菇、平菇和蛹蟲草菌糠多糖的組成與抗氧化性。方法：通過酶解水提、乙醇沉淀和Sevag法脫蛋白步驟獲得5種菌糠多糖，進一步對其組成和抗氧化性進行分析評價。結果：5種菌糠多糖均具有不同程度的抗氧化性，其中茶樹菇菌糠多糖的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，

ORAC）值和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）值最佳，分別達到了1215?mol Trolox/g和281?mol Fe2+/g；而白玉菇與平菇的菌糠多糖對2，2’-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnicacid）diammonium salt，ABTS）自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力較強。

食用菌菌糠；多糖；抗氧化性；茶樹菇；香菇；白玉菇；平菇；蛹蟲草

食用菌菌糠是指利用秸稈、木屑等原料進行食用菌栽培，收獲后的培養(yǎng)基剩余物。其包括菌絲殘體以及培養(yǎng)料殘渣，含有豐富的多糖、氨基酸、菌體蛋白、微量元素與一些食用菌生長代謝產(chǎn)物，是一種可再生利用的生物資源。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計2011年全國食用菌總產(chǎn)量為2570萬t［1］，若按菌糠生成量為鮮菇產(chǎn)量的25%～33%計算［2］，菌糠年產(chǎn)量將達642萬t以上。

目前，食用菌菌糠的利用受到了廣泛關注，如使用靈芝菌糟替代甜菜粕飼養(yǎng)奶牛［3］，借助改性食用菌菌糠吸附重金屬離子［4］，以食用菌菌糠為原料聚合合成多種菌糠基復合高吸水樹脂等［5］。與此同時，菌糠多糖及其活性功能也受到關注，如已報道的杏鮑菇菌糠多糖具有抗氧化性［6］，香菇菌糠多糖具有抑菌性［7］。菌糠多糖的組成功能研究可為菌糠的環(huán)保工業(yè)處理與再生加工利用提供借鑒指導。然而，目前菌糠多糖研究涉及的食用菌種類較少，菌糠潛在應用價值有待深入挖掘。

本研究選用栽培較廣泛的茶樹菇菌糠（主要成分含75%棉籽殼、15%鋸木屑）、香菇菌糠（主要成分為78%鋸木屑）、白玉菇菌糠（主要成分為80%鋸木屑）、平菇菌糠（主要成分為95%玉米芯）和蛹蟲草菌糠（主要成分為82.3%大米、7.6%蠶蛹粉）為材料，利用纖維素酶酶解提取菌糠多糖，通過乙醇醇沉與Sevag法脫蛋白獲得5種菌糠多糖，分析其組成并對其體外抗氧化性能進行評價比較，旨在為不同食用菌菌糠多糖的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

香菇和茶樹菇菌糠天津凱潤食用菌基地；白玉菇、平菇和蛹蟲草菌糠內蒙古園藝研究院。

纖維素酶Cellulase ACCF-4740日本明治制果藥業(yè)株式會社；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯(lián)氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS）、2，2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2’-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH）、牛血清白蛋白、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）美國Sigma-Aldirch公司；氨基酸標準品、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）試劑美國Agilent公司；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖、木糖和熒光素鈉國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

UV-1800紫外分光光度計日本島津公司；Spectra Max M5多功能酶標儀美國Molecular Devices公司；Sorvall Evolution RC高速落地離心機美國Thermo Scientific公司；IKA RV10旋轉蒸發(fā)儀德國IKA集團；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵河南省予華儀器有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Agilent1200Series高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、色譜柱ZORBAX Eclipse-AAA美國Agilent公司；Sugar-Pak色譜柱美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1菌糠多糖酶法提取

取干燥至恒質量的菌糠樣品，粉碎，過80目篩。按1∶20（m/V）的料液比加入二次水，調節(jié)pH值為4.0，加入樣品質量分數(shù)為1%的纖維素酶Cellulase ACCF-4740， 45℃酶解2h，95℃滅酶15min，冷卻離心（6000r/min，15min）得到上清液，然后將上清液用真空旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，再向濃縮液中加入3倍體積的無水乙醇，置4℃冰箱過夜，取出，12000r/min離心15min，收集沉淀，凍干，得醇沉物。

1.3.2Sevag法脫蛋白

取上步醇沉物，以適量去離子水溶解后，加入溶液1/5體積的Sevag試劑（V（氯仿）∶V（正丁醇）=4∶1），劇烈攪拌30min，離心（7500r/min，15min），以除去水層和氯仿層之間的變性蛋白，重復數(shù)次至無明顯蛋白層出現(xiàn)。減壓濃縮除去有機溶劑，凍干，得菌糠多糖。

1.3.3菌糠多糖的總糖含量及蛋白含量測定

采用劉航等［8］的方法和Lowry法［9］分別對菌糠多糖的總糖含量及蛋白質含量進行測定。分別以葡萄糖和牛血清白蛋白為標準品。

1.3.4單糖組成分析

準確稱取待測菌糠多糖10mg置于安瓿瓶中，加入5mL的4mol/L三氟乙酸，封管，120℃油浴中反應6h，氮氣吹干儀除三氟乙酸，加1mL蒸餾水復溶，于Agilent1200HPLC系統(tǒng)上進行分析。分析條件：色譜柱Sugar-Pak（6.5mm×300mm，10?m），柱溫80℃，示差檢測，洗脫劑為超純水，流速0.4mL/min。色譜采集30min。葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、巖藻糖和木糖為標準對照，進樣質量濃度為2mg/mL。

1.3.5氨基酸組成分析

取10mg菌糠多糖，加入6mol/L的HCl，密封后于120℃水解24h。減壓旋蒸去除HCl，使用OPA柱前衍生［10］。HPLC分析條件：色譜柱ZORBAX Eclipse-AAA（4.6mm×150mm，3.5?m），柱溫40℃，338nm波長處進行紫外檢測，流速2mL/min混合溶劑梯度洗脫，流動相組成：溶劑A為pH7.8，40mmol/L的Na2HPO4緩沖鹽溶液，溶劑B為V（乙腈）∶V（甲醇）：V（水）= 45∶45∶10的混合溶劑。流動相梯度變化：0min，0%B；1.9min，0%B；18.1min，57%B；18.6min，100%B；22.3min，100%B；23.2min，0%B；26min，0%B。以250pmol/μL的混合氨基酸做標準對照分析氨基酸組成。1.3.6菌糠多糖抗氧化活性

1.3.6.1氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）

采用Zeng Yan等［11］的方法，使用Spectra Max M5多功能酶標儀進行測試。于96孔板微孔中加入熒光素鈉鹽（70nmol/L，120μL）和20μL的待測樣品，在37℃條件下孵育10min，迅速加入AAPH（12.8mmol/L，60μL）后，每隔1min測量樣品在485nm激發(fā)條件下，528nm波長處熒光發(fā)射強度的變化。以水溶性的VE衍生物Trolox（終濃度：1～8μmol/L）替代不同質量濃度（0.03～1mg/mL）的菌糠多糖樣品水溶液，同板同時操作，用于繪制標準曲線。測定時間為105min，各樣品不同時間的熒光強度分別記為F0、F1、F2…F105。F0為0min時的熒光值，F(xiàn)n為第n分鐘時的熒光值。按式（1）計算樣品熒光變化零階矩曲線下面積（area under curve，AUC）。

根據(jù)標準曲線y =5.001x+13.626（R2=0.9942），式中：x為Trolox濃度/（?mol/L）；y為AUC。計算不同菌糠多糖樣品相當于Trolox的濃度/（?mol/L），然后根據(jù)待測樣品的濃度換算出每克菌糠多糖樣品相當于Trolox物質的量，即ORAC值，以μmol Trolox/g表示。

1.3.6.2ABTS+·清除能力的測定

采用張換等［12］的方法測定。將ABTS+·（7mmol/L，5mL）和過硫酸鉀溶液（140mmol/L，88μL）混合，室溫避光反應12～16h，制備ABTS+·儲備液。使用磷酸鹽緩沖液（10mmol/L，pH7.4）將儲備液稀釋至其在734nm波長處吸光度（A）為0.70±0.02。取100μL不同質量濃度（1～15mg/mL）待測菌糠多糖樣品水溶液，加3mL ABTS+·溶液，暗反應6min，其在734nm波長處的吸光度記錄為A樣品。以100μL純水代替樣品，相同操作，記為A空白。按式（2）計算樣品清除ABTS+·的清除率。

以Trolox為標準繪制標準曲線y=134.73x-0.8895（R2=0.9981），式中：x為Trolox濃度/（mmol/L）；y為ABTS+·清除率。根據(jù)標準曲線計算不同菌糠多糖樣品相當于的Trolox濃度，然后根據(jù)待測樣品的濃度換算出每克菌糠多糖樣品相當于Trolox物質的量，即TEAC值，以μmol Trolox/g表示。

1.3.6.3DPPH自由基清除能力的測定

參照Chen Xiaoli等［13］的方法。配制0.1mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液。1.5mL不同質量濃度（0.25～3mg/mL）待測菌糠多糖樣品水溶液加入1.5mL的DPPH，在避光條件下反應30min，517nm波長處測定吸光度。按式（3）計算樣品清除DPPH自由基的清除率。

式中：A樣品為樣品液與DPPH溶液混合的吸光度；A對照為樣品液與乙醇混合的吸光度；A空白為純水與DPPH試劑混合的吸光度。

利用不同菌糠多糖待測樣的質量濃度對DPPH自由基抑制率擬合二次曲線方程，通過方程換算不同菌糠多糖待測樣品的半抑制率，即對DPPH自由基清除率為50%時的樣品質量濃度，以IC50值表示。

1.3.6.4鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

參照Chen Shiguo等［14］方法并稍作改進。新鮮FRAP反應液配制：300mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH3.6），10mmol/L的TPTZ溶液（40mmol/L HCl為溶劑）以及20mmol/L的FeCl3溶液，三者以體積比10∶1∶1混合后，于37℃水浴保溫。100μL不同質量濃度（1～15mg/mL）待測菌糠多糖樣品水溶液與3.0mL FRAP試劑混合，37℃條件下保溫5min，測定其在593nm波長處的吸光度。

以0.1mL FeSO4溶液（濃度為0.2～1mmol/L）替代樣品制作標準曲線y=0.0007x+0.0516（R2=0.9998），式中：x為FeSO4濃度/（mmol/L）；y為吸光度。根據(jù)標準曲線計算不同菌糠多糖樣品相當于的Fe2+濃度/（?mol/L），然后根據(jù)待測樣品的濃度換算出每克菌糠多糖樣品相當于Fe2+的物質的量，即FRAP值，以?mol Fe2+/g表示。

2　結果與分析

2.1菌糠多糖的化學組成和單糖組成結果比較

文獻表明Sevag法脫蛋白操作后，獲得的樣品除多糖外還可能含有蛋白質、色素以及糖醛酸等成分［15-16］。由于多次重復這一操作后檢測到的蛋白質大多以與多糖結合的形式存在［17］，而結合蛋白的多寡對多糖的抗氧化性有重要影響，因此，糖和蛋白質是多糖中備受關注的成分［18］。5種菌糠多糖的糖和蛋白質的質量分數(shù)測定結果見表1。蛹蟲草菌糠多糖中糖的質量分數(shù)較高，為81.7%；其次為平菇和白玉菇菌糠多糖，分別為73.1%和67.9%；香菇和茶樹菇菌糠多糖中糖的質量分數(shù)較低。5種菌糠多糖均含有不同質量分數(shù)的蛋白質，以糖蛋白比例為指標進行比較，香菇菌糠多糖的糖蛋白相對比例最低，其次為白玉菇和平菇菌糠多糖。5種菌糠多糖的氨基酸組成結果見表2。其中，甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸含量均較高。作為食用菌濃郁鮮味的主要來源，白玉菇、茶樹菇和香菇菌糠多糖中谷氨酸含量是蛹蟲草菌糠多糖的2倍。白玉菇、茶樹菇和香菇菌糠多糖中氨基酸組成相同，僅在物質的量百分比上存在差異；而蛹蟲草菌糠多糖中氨基酸種類較多，增加了組氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。除此之外，值得特別關注的是5種菌糠多糖中均含有不同物質的量百分比的絲氨酸，尤其是白玉菇菌糠多糖的絲氨酸含量最高，平菇次之。由于絲氨酸和蘇氨酸是蛋白與多糖通過O-糖苷鍵結合的重要標志［19］，因此，進一步證明5種菌糠多糖均存在結合蛋白。

菌糠多糖的單糖組成分析結果見表3，白玉菇、茶樹菇和平菇菌糠多糖的單糖組成相似，均含有葡萄糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖。其中，白玉菇和平菇菌糠多糖的單糖組成以半乳糖為主，而茶樹菇菌糠多糖主要由葡萄糖與半乳糖以物質的量比5.7∶3.9組成。蛹蟲草菌糠多糖的單糖主要是葡萄糖，并含有少量的半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。而香菇菌糠多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖以4.2∶5.0∶0.8的物質的量比組成。

表1　5種食用菌菌糠多糖的多糖和蛋白質含量Table1The contents of sugar and proteinotein

表25種食用菌菌糠多糖的氨基酸組成Table2Amino acid compositionition

表35種食用菌菌糠多糖的單糖組成Table3Monosaccharide compositionition

2.2菌糠多糖抗氧化效果比較

抗氧化實驗中，鑒于抗氧化劑復雜的作用機制，沒有任何一種單一的測試可以精確反映菌糠多糖的抗氧化能力。因此，選用了基于氫轉移反應機制（ORAC）和單電子轉移反應機制（ABTS+·和DPPH自由基）的清除實驗。同時，由于抗氧化劑介導的自由基猝滅實驗與其參與的氧化還原反應有很大不同，也采用了FRAP實驗進行菌糠多糖的抗氧化性測定。

2.2.1ORAC抗氧化性評價體系

圖1　不同菌糠多糖的氧自由基清除能力Fig.1Oxygen radical absorbance capacity of polysaccharides from different spent mushroom substrates

由圖1可知，茶樹菇菌糠多糖的ORAC值為1215?mol Trolox/g，不僅明顯高于本實驗中其他菌糠多糖，也高于You Lijun等［20］報道的松口蘑多糖TM-P2（ORAC值894.23?mol Trolox/g），與Ma等［21］報道的靈芝多糖GLP的ORAC值1200?mol Trolox/g相當，這說明茶樹菇菌糠多糖具有較好的抗氧自由基活性，能與一些食用菌子實體多糖抗衡。其中，白玉菇菌糠和平菇菌糠的ORAC值略高于香菇菌糠多糖，分別為290、307、256?mol Trolox/g；蛹蟲草菌糠多糖的ORAC值最低，僅為38?mol Trolox/g。

2.2.2ABTS+·清除能力

圖2不同菌糠多糖的ABTSABTS+·清除能力Fig.2ABTS radical scavenging activity of polysaccharides from different spent mushroom substrates

如圖2所示，5種菌糠多糖ABTS+·清除率實驗的TEAC值分別為92.6（白玉菇）、86.4（平菇）、63.4（茶樹菇）、44.4（香菇）、25.2（蛹蟲草）?mol Trolox/g。就TEAC值而言，白玉菇和平菇的菌糠多糖的表現(xiàn)高于茶樹菇、香菇和蛹蟲草菌糠多糖，也高于來源于Lentinus polychrous Lév子實體多糖［22］，后者的TEAC值為68?mol Trolox/g。

2.2.3DPPH自由基清除能力

圖3不同菌糠多糖的DPPH自由基清除能力Fig.3DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from different spent mushroom substrates

樣品對DPPH自由基的半抑制率IC50值越低，說明其清除自由基能力越強。5種菌糠多糖的DPPH自由基清除能力如圖3所示。其中，白玉菇和平菇菌糠多糖對DPPH自由基的IC50值分別為0.86、0.85mg/mL。清除DPPH自由基的能力較其他3種菌糠多糖強，且略高于Dong Caihong等［23］報道來源于人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體多糖和野生冬蟲夏草多糖對DPPH自由基的IC50值，分別為0.93、1.23mg/mL。這說明除ABTS+·清除能力較強外，白玉菇和平菇菌糠多糖對DPPH自由基也具有較好的清除能力。另外，茶樹菇菌糠多糖清除DPPH自由基的半抑制濃度IC50值1.13mg/mL低于香菇菌糠多糖的IC50值1.45mg/mL，說明茶樹菇菌糠多糖的DPPH自由基清除能力略高于香菇菌糠多糖，蛹蟲草菌糠多糖在DPPH乙醇溶液中極易沉淀，導致反應體系混濁，無法準確測量其對DPPH自由基的清除能力，因此圖中沒有顯示。

2.2.4FRAP抗氧化性評價體系

圖4不同菌糠多糖的總還原能力Fig.4Total reducing power of polysaccharides from different spent mushroom substrate

如圖4所示，茶樹菇菌糠多糖的FRAP值最高，達到281?mol Fe2+/g，平菇菌糠多糖次之，為131?mol Fe2+/g，白玉菇菌糠和香菇菌糠多糖的FRAP值相近，分別為85、80?mol Fe2+/g，4種菌糠多糖的FRAC值均高于Huang Shengquan等［24］報道的樺褐孔菌多糖IOP1b的FRAP值73?mol Fe2+/g，說明此4種菌糠多糖都具有較好的鐵還原能力。Cheung Yiching等［25］比較了超聲波提取和熱水浸提灰樹花、云芝和香菇糖蛋白復合物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)超聲波提取云芝多糖的鐵還原能力FRAP值最高，為160?mol Fe2+/g，卻仍低于本實驗中茶樹菇菌糠多糖FRAP值，這說明酶解獲得的茶樹菇菌糠多糖表現(xiàn)出較好的鐵離子還原能力。

對多糖而言，其結構組成如結合蛋白含量與單糖組成不同等，都會對多糖的抗氧化性產(chǎn)生影響。Liu等［18］發(fā)現(xiàn)與香菇多糖提取物相比，糖蛋白比例低的靈芝和灰樹花多糖提取物卻具有更好的清除自由基能力。從綠茶分離純化得到3種多糖中結合蛋白含量高的多糖TPC-3的抗氧化性最好，Chen Haixia等［26］認為這是因為結合蛋白對多糖的抗氧化性有顯著貢獻。Tsiapali等［27］認為骨架中單糖結構提供異頭氫原子的難易直接影響多糖參與抗氧化作用的大小。Peng Zhenfei等［28］通過單糖組成分析發(fā)現(xiàn)從海帶獲得的多糖中，巖藻糖含量高的多糖WPS-1與WPS-2其抗氧化性大于半乳糖含量高的多糖WPS-3，巖藻糖作為單糖組成成分對多糖的生物活性有重要影響。在上述4種抗氧化測試中，白玉菇、平菇、茶樹菇菌糠多糖表現(xiàn)優(yōu)于香菇和蛹蟲草菌糠，這一結果與上述報道一致，進一步說明菌糠多糖的抗氧化性與其結構組成息息相關。

3　結論

通過纖維素酶解、乙醇沉淀與Sevag法脫蛋白操作，從茶樹菇、白玉菇、平菇、香菇和蛹蟲草菌糠中獲得了5種多糖，并對其進行了相關的結構分析與抗氧化性測試。結果表明，5種菌糠多糖的結合蛋白多寡、單糖組成不同都對菌糠多糖的抗氧化效果有影響。結合蛋白質量分數(shù)相對高的白玉菇和平菇菌糠多糖能有效地通過單電子轉移機制猝滅自由基，另外推測單糖組成中含有巖藻糖的茶樹菇、白玉菇和平菇菌糠多糖在氫轉移反應機制的自由基消除以及還原能力上表現(xiàn)出眾。

食用菌菌糠多糖的原料來源廣，提取工藝簡單，在不同的測試中又顯示出良好的抗氧化性，其作為一種天然抗氧化劑應有良好的開發(fā)前景。

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Monosaccharide Composition and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Different Spent Mushroom Substrates

ZHANG Ying1，ZENG Yan2，ZHANG Lijiao2，CUI Shimao1，SUN Yuanxia2，*
（1.Agricultural College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010010，China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin300308，China）

This study aimed to compare the composition and antioxidant activity of polysaccharides from spent mushroom substrates of Agrocybe cylindracea，Lentinus edodes，white Hypsizygus marmoreu，Pleurotus ostreatus and Cordyceps militaris.The polysaccharides were prepared after enzymatic extraction with cellulase，precipitation with ethanol and deproteinization with Sevag regent，and then their monosaccharide composition and antioxidant activities were measured.The results showed that all the polysaccharides had antioxidant activities.Therein，the polysaccharides from spent mushroom substrate of Agrocybe cylindracea had the best oxygen free radical scavenging capacity and ferric reducing power，with ORAC value of1215?mol equivalent Trolox/g and FRAP value of281?mol equivalent Fe2+/g.The polysaccharides from spent mushroom substrates of white Hypsizygus marmoreus and Pleurotus ostreatus possessed better ABTS and DPPH radical scavenging activities than that from other spent mushroom substrates.

spent mushroom substrates；polysaccharide；antioxidant activity；Agrocybe cylindracea；Lentinus edodes；white Hypsizygus marmoreu； Pleurotus ostreatus；Cordyceps militaris

TQ929.2

A

1002-6630（2015）05-0018-06

10.7506/spkx1002-6630-201505004

2014-05-13

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA021403）；天津市科技支撐計劃重點項目（12ZCZDSY12800）

張穎（1980—），女，助理研究員，博士研究生，研究方向為食用菌多糖結構與功能。E-mail：yingzhang80@126.com

孫媛霞（1963—），女，研究員，博士，研究方向為功能糖與天然產(chǎn)物活性物質。E-mail：syx0430@hotmail.com