郭曉娟，袁 杰，王勝朝，余 擎，屈鐵軍

(1.平?jīng)鍪腥嗣襻t(yī)院口腔科，甘肅平?jīng)?44000;2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院:*口腔預(yù)防科，＊＊牙體牙髓病科，陜西西安710032)

尼古丁是一種生物堿，無(wú)臭，味辛辣，為無(wú)色或灰黃色的油狀液體。流行病學(xué)調(diào)查表明尼古丁是損害牙胚并導(dǎo)致牙齒發(fā)育異常的眾多因素之一［1］。體外實(shí)驗(yàn)亦表明尼古丁能夠顯著抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖［2］，而牙本質(zhì)形成過(guò)程包括細(xì)胞分化、成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)和基質(zhì)礦化等階段，有多種外界因素和內(nèi)在信號(hào)分子參與其中［3］。個(gè)體牙齒萌出后，受到外源刺激，可能出現(xiàn)局部成牙本質(zhì)細(xì)胞的凋亡或者壞死，而牙髓組織中的未分化外胚間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步分化為牙本質(zhì)樣細(xì)胞，然后通過(guò)不斷地合成和分泌牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)，生成修復(fù)性牙本質(zhì)，從而促進(jìn)基質(zhì)礦化［4-5］。此過(guò)程一旦出現(xiàn)異常，就會(huì)導(dǎo)致牙本質(zhì)形成缺陷或者礦化不良。因此，鑒于成牙本質(zhì)細(xì)胞在牙齒發(fā)育和改建過(guò)程中的關(guān)鍵作用，研究尼古丁對(duì)其分化、發(fā)育乃至凋亡的作用機(jī)制具有重要意義。

本研究擬以永生化的成牙本質(zhì)細(xì)胞MDPC-23為研究對(duì)象，分別進(jìn)行不同濃度尼古丁刺激和SP600125作用，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3以及p-JNK等表達(dá)，以此探究尼古丁對(duì)小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

小鼠成牙本質(zhì)樣細(xì)胞系MDPC-23細(xì)胞(ATCC，美國(guó));α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó));Hoechst33258熒光染料、抗熒光淬滅封片液、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(上海碧云天);細(xì)胞培養(yǎng)用蓋玻片、載玻片(上海生工);BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo，美國(guó));Bax兔多抗、Bcl-2鼠單抗、Caspase-3兔多抗(Upstate，美國(guó));SP600125、鼠抗 β-actin、尼古丁(sigma，美國(guó));抗p-JNK抗體(Cell Signaling Technology，美國(guó));6孔板(Corning，美國(guó));倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MDPC-23細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清、50 μg/mL 谷氨酰胺、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素和50 μg/mL抗壞血酸的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行。所有含1、10、100 μg/mL等濃度尼古丁和SP600125的培養(yǎng)液均由含2 mL/L胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基配制。

1.3 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將MDPC-23細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板內(nèi)的蓋玻片上，24 h后，細(xì)胞換液，分為0、1、10、100 μg/mL 4個(gè)濃度尼古丁處理組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL Hoechst 33258染色液，10 min后吸去染液，無(wú)菌PBS洗3次×3 min。將各蓋玻片分別倒扣于滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，各選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

將MDPC-23細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板，24 h 后，細(xì)胞換液，分為 0、1、10、100 μg/mL 4個(gè)濃度尼古丁處理組。24 h后，收集細(xì)胞，加入RAPI細(xì)胞裂解液，提取全蛋白。經(jīng)BCA定量后，上樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育和ECL顯影等步驟，檢測(cè)各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin等的表達(dá)水平。

1.5 Western blot檢測(cè)p-JNK和Caspase-3表達(dá)

將MDPC-23細(xì)胞以5×105/孔的密度接種于6孔板，24 h后進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)。12 h后，細(xì)胞換液，分為0、1、10、100 μg/mL 4 個(gè)濃度尼古丁處理組。各濃度組分別設(shè) 45、60、90、180 min各時(shí)間點(diǎn)。另設(shè)尼古丁和JNK抑制劑SP600125共同作用組，無(wú)血清培養(yǎng)12 h后，依次加入10 μmol/L SP600125 孵育1 h，10 μg/mL 尼古丁處理 90 min。分別收集細(xì)胞，制備全蛋白裂解液，Western blot分別檢測(cè)p-JNK、Caspase-3和β-actin等蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組測(cè)定數(shù)值的均值進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的比較，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 尼古丁刺激促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡

熒光顯微鏡觀察顯示，對(duì)照組MDPC-23細(xì)胞為正常生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)分布均勻，核邊界清晰規(guī)則;0、1、10、100 μg/mL 尼古丁處理24 h后，部分細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征，核邊界模糊，細(xì)胞核致密濃縮，不均勻，有碎塊(圖1)。隨著尼古丁濃度增加，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越來(lái)越明顯，凋亡細(xì)胞數(shù)目和凋亡率均呈明顯上升趨勢(shì)(P＜0.05)(圖2)。

圖1 各尼古丁濃度組細(xì)胞凋亡形態(tài)變化(熒光染色，×400)

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.2 尼古丁刺激對(duì)MDPC-23細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組MDPC-23細(xì)胞相比，不同濃度尼古丁處理組細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)(圖3)。而且隨著尼古丁濃度增加，Bcl-2表達(dá)的下調(diào)和Bax、Caspase-3表達(dá)的上調(diào)均呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。

圖3 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

2.3 尼古丁對(duì)MDPC-23細(xì)胞中p-JNK表達(dá)水平及其抑制劑SP600125對(duì)Caspase-3表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著尼古丁濃度和作用時(shí)間的增加，p-JNK表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖4)。除1 μg/mL尼古丁刺激45 min組外，其他各處理組與對(duì)照組的p-JNK表達(dá)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。此外，與單獨(dú)尼古丁作用組相比，10 μg/mL尼古丁和JNK抑制劑SP600125共同作用組的Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)(圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)p-JNK和Caspase-3表達(dá)水平

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動(dòng)有序的生理性死亡過(guò)程，發(fā)生在生命個(gè)體的各個(gè)階段，作用在于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。研究表明，抗凋亡作用的Bcl-2基因和促凋亡作用的Bax基因主要通過(guò)二者表達(dá)量的比值Bcl-2/Bax來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程;Caspase-3是Caspase家族中最為重要的成員之一，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，Caspase-3一旦被激活，細(xì)胞凋亡的發(fā)生將不可避免［6］。而若凋亡失控，則易引起多種疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1～100 μg/mL不同濃度尼古丁作用下，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，促進(jìn)了MDPC-23細(xì)胞的凋亡，與Hoechst33258染色所觀察到的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯凋亡變化的現(xiàn)象一致。

成牙本質(zhì)細(xì)胞作為牙髓和牙本質(zhì)復(fù)合體的連接紐帶，其細(xì)胞突起深入至牙本質(zhì)中，是牙髓內(nèi)最早接觸外來(lái)刺激的細(xì)胞。在外界刺激引起的齲病、牙髓病變過(guò)程中，成牙本質(zhì)細(xì)胞亦被認(rèn)為是最先受到損傷影響的細(xì)胞群［7］，與牙髓細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)反應(yīng)并形成修復(fù)性牙本質(zhì)密切相關(guān)。此外，煙草嚴(yán)重危害健康，大量臨床資料表明，吸煙與胃炎、心梗、哮喘、高血壓、氣管炎、中樞系統(tǒng)疾病以及癌癥等許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］，而尼古丁作為煙草毒性物質(zhì)的主要成分，對(duì)牙周組織的損害已為國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可［1，9-11］，但對(duì)其具體生理機(jī)制的研究尚有許多不確定之處。

正常人吸煙后血漿中的尼古丁含量約22.6～73 ng/mL［12］，為此，本實(shí)驗(yàn)將尼古丁濃度設(shè)定為0、1、10、100 μg/mL，該濃度范圍遠(yuǎn)大于上述血漿中的含量，但作用時(shí)間設(shè)為24 h，旨在探討尼古丁對(duì)細(xì)胞毒性作用的劑量依賴(lài)關(guān)系。有資料顯示，100 μg/mL尼古丁能夠顯著抑制成牙本質(zhì)細(xì)胞的增殖［2］，并且尼古丁損害牙齒發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制可能主要通過(guò)不同尼古丁型乙酰膽堿受體nAchR介導(dǎo)，經(jīng)由該跨膜五聚體離子通道受體，啟始胞內(nèi)信號(hào)傳遞。目前已發(fā)現(xiàn)的下游尼古丁相關(guān)信號(hào)通路有Ca2+、MAPK途徑(ERK、p38和JNK/SAPK)、AKT和線(xiàn)粒體途徑等，這些通路或抗凋亡，或促凋亡，均與細(xì)胞凋亡相關(guān)。其中JNK，即c-JNK氨基末端激酶，又稱(chēng)應(yīng)急活化蛋白激酶(SAPK)，一般作為促凋亡信號(hào)通路的一部分;JNK通路激活會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，而特異性阻斷JNK激活，可表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的保護(hù)性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，1～100 μg/mL不同濃度尼古丁作用下，該MDPC-23細(xì)胞的JNK磷酸化水平在一定時(shí)間段(45～180 min)內(nèi)呈濃度依賴(lài)性增強(qiáng)，促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞的凋亡，而JNK抑制劑則可一定程度上阻斷該細(xì)胞的凋亡發(fā)生。

綜上所述，本研究通過(guò)不同濃度的尼古丁刺激和JNK抑制劑作用，檢測(cè)了成牙本質(zhì)細(xì)胞MDPC-23的形態(tài)變化、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3以及p-JNK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)尼古丁刺激可顯著促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞凋亡。該結(jié)果表明，若生物個(gè)體長(zhǎng)時(shí)間被動(dòng)或者主動(dòng)吸煙，煙草中毒性物質(zhì)的主要成分尼古丁可能誘使口腔內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡，并影響牙胚的發(fā)育［1］，特別是切牙的形成［9］、嚴(yán)重時(shí)會(huì)致畸［13］，甚至出現(xiàn)齲齒病狀［14］，導(dǎo)致牙齒發(fā)育異常，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

在牙髓生物學(xué)領(lǐng)域，尼古丁對(duì)牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞影響的調(diào)控作用已得到公認(rèn)［10-11］，但是尼古丁對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞影響的相關(guān)研究還比較少。本實(shí)驗(yàn)初步探究了尼古丁對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響，而對(duì)尼古丁調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞的復(fù)雜作用及成牙本質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的深入研究。

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