劉雪飛，張 旭，林 江

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱150001)

牙槽骨吸收是牙周炎的典型病理性改變，也是判定患牙預(yù)后的重要依據(jù)［1］。牙槽骨吸收包括牙槽骨體積減小和牙槽骨密度的降低，雖可通過組織病理形態(tài)學(xué)計(jì)量法對其進(jìn)行評估，并一直被視為是評估骨吸收的金標(biāo)準(zhǔn)［2］;但組織病理切片制作耗時(shí)耗力［3］，不僅破壞樣本，而且標(biāo)本易變形，難以保證切面測量位點(diǎn)的準(zhǔn)確性［4］，更無法測量三維(three-dimensional，3-D)體積，從而影響了評估的準(zhǔn)確性。而骨密度的測定主要是通過X線片光密度法或各種骨密度儀，其所獲得的數(shù)值雖能在一定程度上代表骨密度，但不能反映骨微結(jié)構(gòu)的密度改變［5］。近年來高分辨率的微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)作為一種無損檢測手段，因其圖像三維重建功能可清晰顯示骨組織的立體結(jié)構(gòu)，并能通過精確測量各骨小梁參數(shù)而真實(shí)反映骨微結(jié)構(gòu)的性質(zhì)［6］，近年來已逐漸在醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域中廣泛用于對骨組織的評估。但是牙槽骨疏松多孔，當(dāng)發(fā)生骨破壞時(shí)則呈現(xiàn)出非均一性，并且在影像學(xué)圖像中，牙槽骨的密度與牙根組織的密度比較接近，計(jì)算機(jī)很難自動(dòng)識(shí)別和分割;因此僅通過Micro-CT圖像的常規(guī)分析難以準(zhǔn)確三維定量分析牙槽骨的骨量，所以現(xiàn)大多數(shù)研究只限于進(jìn)行定性診斷和兩維定量評估。本研究運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中的對偶運(yùn)算，對Micro-CT圖像進(jìn)行腐蝕-膨脹(Erode-Dilate)處理，使之快速、準(zhǔn)確將牙體組織與牙槽骨組織進(jìn)行識(shí)別和無損性分割;然后再結(jié)合MedCAD模塊中的球形(Sphere)三維分析法，定量分析小鼠第二磨牙(the second molar，M2)周圍剩余骨量。

1 材料和方法

1.1 建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型

取8周齡健康C57雌性小鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)20只，體質(zhì)量(20±1)g，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組(n=10)。實(shí)驗(yàn)組參照Lin［7］報(bào)道的方法，用5-0絲線結(jié)扎各小鼠的雙側(cè)上頜第二磨牙(the second molar，M2)牙頸部，并將絲線置于齦溝內(nèi)建立實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型;對照組不作任何處理，置于實(shí)驗(yàn)組同樣飼養(yǎng)環(huán)境［溫度(23±1)℃，相對濕度(60±5)%］，12 h晝夜循環(huán)照明下進(jìn)行飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。2周后實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型建立成功，分別處死所有大鼠并取其上頜骨，用于進(jìn)行Micro-CT掃描。

1.2 Micro-CT掃描

分別將各小鼠的上頜骨標(biāo)本置于 Micro-CT系統(tǒng)的檢測試管內(nèi)，以空氣為介質(zhì)，應(yīng)用分辨率為1 024×1 024 的 μCT40(Scanco Medical，瑞士)進(jìn)行掃描。掃描時(shí)保持牙長軸與掃描平面垂直，掃描參數(shù):360°旋轉(zhuǎn)，管電壓 70 kV，管電流 114 μA，整合時(shí)間300 ms，像素點(diǎn)尺寸12 μm ×12 μm，層間距12 μm。掃描結(jié)束后，通過三維重建獲得 DICOM格式待分析圖像。

1.3 Micro-CT圖像分析方法

1.3.1 二維線性分析

調(diào)整所有圖像使第一磨牙(M1)、第二磨牙(M2)、第三磨牙(M3)的釉牙骨質(zhì)界(cementalenamelo junction，CEJ)與根尖孔(root apex，RA)處在同一矢狀水平的二維(two-dimensional，2-D)切片上，然后應(yīng)用Mimics 16.0軟件進(jìn)行2-D線性分析。通過線性分析(圖1)分別測量出M1-M2或M2-M3之間 CEJ到牙槽骨嵴頂(alveolar bone crest，ABC)的距離，以及CEJ到RA之間的根長度(RLs，以mm為單位);然后按照表1中所列的公式1、2［8］，計(jì)算出各自用以評估矢狀面余留骨量的百分比。

1.3.2 三維體積分析

應(yīng)用Mimics 16.0軟件獲取各組各動(dòng)物包含牙槽骨及牙齒的Micro-CT圖像，并在Micro-CT圖像中分別測量各動(dòng)物的M2根分叉到M1遠(yuǎn)中頰根RA的距離。然后再運(yùn)用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的Erode-Dilate進(jìn)行相關(guān)運(yùn)算:①通過對圖像進(jìn)行Erode運(yùn)算，以消除牙齒與牙槽骨圖像的邊界點(diǎn)，并使邊界向內(nèi)部收縮;②運(yùn)用區(qū)域生長算法，將具有相似性的像素集合起來，從而選中牙齒圖像;③先運(yùn)用波爾運(yùn)算獲得Erode后的獨(dú)立牙槽骨圖像，然后再運(yùn)用Dilate算法對牙槽骨圖像進(jìn)行膨脹處理使之恢復(fù)到原始像素水平，從而將牙齒圖像(圖2綠色部分)與牙槽骨圖像(圖2紫色部分)無損性的完全分離，并同時(shí)將牙齒圖像進(jìn)行3-D化而得到牙齒的3-D圖像(圖2青色部分)。上述計(jì)算結(jié)束后，用MedCAD模塊中的球形(Sphere)確定ROI(圖2):以先前計(jì)算得到的M2根分叉到M1遠(yuǎn)中頰根RA的距離(平均值)作為Sphere的半徑r，并將Sphere的中心調(diào)整至M2的根分叉處;然后將2-D的Sphere 3-D化(圖2紅色部分)，最后再將ROI及ROI內(nèi)的牙槽骨圖像進(jìn)行3-D化，此時(shí)軟件會(huì)自動(dòng)生成ROI的總體積(Total volume，TV)、ROI內(nèi)牙槽骨(圖2藍(lán)色部分)的骨小梁體積(Trabecular bone volume，BV)、骨表面積(Trabecular bone surface，BS);所得數(shù)據(jù)即可按表1中的公式3、4、5、6［9］分別計(jì)算出 ROI內(nèi)牙槽骨的骨體積分?jǐn)?shù)(Bone Volume Fraction，BVF)、骨小梁數(shù)目(Trabecular Number，Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(Trabecular Separation，Tb.Sp)等骨微參數(shù)(表2)。

表1 各種分析方法的計(jì)算公式

圖1 Micro-CT圖像2-D線性分析

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間各相應(yīng)數(shù)據(jù)()的比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。并同時(shí)對不同檢測者采用兩種方法分析的結(jié)果進(jìn)行可靠性和可重復(fù)性的相關(guān)性分析，分別分析其組內(nèi)、組間的相關(guān)系數(shù)(ICC)和變異系數(shù)(CV)。其中ICC值為0～1，越接近于1，可靠性越強(qiáng);＞0.75時(shí)，即表示具有良好的可靠性［10］。變異系數(shù)［CV(%)=SD/其平均值×100%］作為精度誤差可描述測量的可重復(fù)性［11］，從而能檢驗(yàn)檢測者的組內(nèi)和組間變異。

2 結(jié)果

2-D線性分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組牙槽骨余留量少于對照組(P＜0.05)(圖3)。

3-D體積分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th各骨微參數(shù)均小于對照組(P＜0.05)(圖4a～c);而Tb.Sp的分析結(jié)果則是實(shí)驗(yàn)組明顯大于對照組(P＜0.05)(圖4d)。

對不同檢測者采用兩種方法分析的結(jié)果進(jìn)行可靠性和可重復(fù)性分析顯示，2-D分析方法時(shí)檢測者的組內(nèi)變異為:ICC值均＞0.75、CV值均＞1.5%;組間變異為:ICC值＜0.75、CV值＞1.5%，可靠性與可重復(fù)性相對較差;而采用3-D分析方法時(shí)檢測者的組內(nèi)變異和組間變異均為ICC值均＞0.75、CV值均＜1.5%，可靠性與可重復(fù)性均很好(表2)。

對同一檢測者采用兩種方法所需的檢測時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，3-D分析方法所需的檢測時(shí)間明顯少于2-D分析方法(圖5)。

表2 檢測者之間相關(guān)性檢測

圖4 3-D體積分析比較各組的骨微參數(shù)(*P＜0.05)

圖5 2-D線性距離分析與3-D體積分析用時(shí)比較(*P＜0.05)

3 討論

牙周炎中牙槽骨的吸收呈現(xiàn)連續(xù)性的非均一性，作為其檢測標(biāo)準(zhǔn)的組織病理切片因有時(shí)切不到牙槽骨吸收的位置，所以不能真正體現(xiàn)不規(guī)則的牙槽骨吸收情況，也不能實(shí)時(shí)的反映牙槽骨量的變化。而Micro-CT可以在不破壞樣品的情況下，對骨骼、牙齒、生物材料等離體樣本和活體小動(dòng)物進(jìn)行高分辨率(幾十微米到亞微米級)的X射線成像，從而獲得樣品內(nèi)部詳盡的三維結(jié)構(gòu)信息［12］。利用Micro-CT圖像可檢驗(yàn)的參數(shù)包括:BVF、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N 等［13］，其中 BVF 是指礦化的骨組織所占總體積的比例;Tb.Th用來比較骨小梁的粗細(xì)程度;Tb.Sp可反映骨小梁之間間隙的寬窄水平;Tb.N可反映骨小梁連接的緊密度。以上這些參數(shù)均可在骨微結(jié)構(gòu)上反映牙槽骨的變化。

有研究［14-20］表明，Micro-CT的2-D 形態(tài)學(xué)測量與傳統(tǒng)的組織病理的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果具有高度相關(guān)性，是一種可以取代普通組織病理切片的新方法［9］，所以本實(shí)驗(yàn)選擇2-D線性分析作為趨勢對比。但是應(yīng)用Micro-CT圖像進(jìn)行2-D分析的研究［21-26］無法觀察牙槽骨在空間各個(gè)方向上的變化以及骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)，更無法評估骨組織三維體積的變化，顯然會(huì)降低測量的準(zhǔn)確度和敏感度。Micro-CT中對骨量的三維定量分析需要通過密度識(shí)別而準(zhǔn)確分割目標(biāo)組織，但是由于牙槽骨與牙根組織的密度在影像學(xué)圖像上很接近，計(jì)算機(jī)不能準(zhǔn)確的自動(dòng)識(shí)別，從而限制了Micro-CT對牙槽骨定量分析的應(yīng)用。雖然也有很多學(xué)者試圖通過不同的標(biāo)志點(diǎn)或者平面水平，選取各自不同的ROI對牙槽骨的Micro-CT圖像進(jìn)行了3-D分析［27-30］，從而進(jìn)行吸收量的評估，如密歇根大學(xué)的Park等通過手動(dòng)的方法描繪Micro-CT各個(gè)2-D圖像上的牙槽骨邊界，從而達(dá)到牙槽骨與牙齒分離的效果，然后再進(jìn)行3-D骨微參數(shù)的計(jì)算，并進(jìn)行余留牙槽骨的三維定量評估［8］。但這些方法在分析和操作的過程均過于繁瑣，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大。所以，怎樣將牙根及其周圍的牙槽骨進(jìn)行有效的快速分離，始終是阻礙開展應(yīng)用Micro-CT定量評估牙槽骨的瓶頸問題;另外在Mircro-CT圖像上，以往研究也無理想的解剖定位標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致了數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性較差，難以作多樣本圖像之間的準(zhǔn)確比較，以上這些就是本研究著力解決的問題。

本研究中運(yùn)用了數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中的運(yùn)算:腐蝕(Erode)和膨脹(Dilate)，其基礎(chǔ)是集合論，即在圖像的處理中將其所有的像素點(diǎn)當(dāng)作一個(gè)集合，然后通過結(jié)構(gòu)元素來對圖像進(jìn)行探查，并對具有一定形態(tài)的結(jié)構(gòu)元進(jìn)行測量和提取圖像中的對應(yīng)形狀，以達(dá)到對圖像分析和識(shí)別的目的［31-32］?；谶@一理論，運(yùn)用Erode-Dilate運(yùn)算可以優(yōu)化圖像數(shù)據(jù)、保持它們基本的形狀特性、排除不相干的結(jié)構(gòu)，并能實(shí)現(xiàn)對圖像的邊緣檢測、特征提取和圖像分割，從而達(dá)到準(zhǔn)確、快速，且無損性的分離出牙齒與牙槽骨的目的。同時(shí)使用MedCAD模塊中的Sphere，特異的選取了根分叉、根尖孔等解剖標(biāo)志點(diǎn)作為定位點(diǎn)對ROI進(jìn)行選取，使之包含全部的牙周病損部位。結(jié)果證實(shí)，該方法具有極高的可重復(fù)性，不僅實(shí)現(xiàn)了定位準(zhǔn)確的目的，還更便于相關(guān)分析人員的辨認(rèn)和操作。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析的結(jié)果與2-D分析比較趨勢一致，并證實(shí)通過絲線結(jié)扎可導(dǎo)致小鼠的牙槽骨吸收。Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的余留牙槽骨量Tb.N、Tb.Th均較對照組明顯降低，而Tb.Sp則較對照組明顯升高。以上結(jié)果不僅從骨微結(jié)構(gòu)上證明了實(shí)驗(yàn)組的牙槽骨密度明顯降低，同時(shí)也表明了Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法與2-D測量相比，在對牙槽骨吸收的評估中具有更高的靈敏性;并且該方法的離散程度小，靈敏度高，包含的骨評價(jià)指標(biāo)更多，可靠性好。對兩種分析方法所需的檢測時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析也表明，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法與2-D分析法相比，具有高效、省時(shí)的特點(diǎn)。

綜上所述，Erode-Dilate結(jié)合MedCAD模塊中的Sphere 3-D分析法可有效的評估牙槽骨量，是一種非常實(shí)用的Micro-CT圖像分析方法，有望未來將其應(yīng)用于臨床進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的牙周炎診斷和療效評估。

［1］Pihlstrom BL，Michalowicz BS，Johnson NW.Periodontal diseases［J］.Lancet，2005，366(9499):1809-1820.

［2］Dalle Carbonare L，Valenti MT，Bertoldo F，et al.Bone microarchitecture evaluated by histomorphometry［J］.Micron，2005，36(7-8):609-616.

［3］Gielkens PF，Schortinghuis J，de Jong JR，et al.A comparison of microCT，microradiography and histomorphometry in bone research［J］.Arch Oral Biol，2008，53(6):558-566.

［4］González-Garcia R，Monje F.Is micro-computed tomography reliable to determine the microstructure of the maxillary alveolar bone?［J］.Clin Oral Implants Res，2013，24(7):730-737.

［5］朱春風(fēng).骨密度影像學(xué)測量方法簡介［J］.山西醫(yī)藥雜志，2013，42(6):642-644.

［6］Liu SP，Liao EY，Chen J，et al.Effects of methylprednisolone on bone mineral density and microarchitecture of trabecular bones in rats with administration time and assessed by microcomputed tomography［J］.Acta Radiol，2009，50(1):93-100.

［7］Lin J，Bi LJ，Yu X，et al.Porphyromonas gingivalis exacerbates ligature-induced，RANKL-dependent alveolar bone resorption via differential regulation of Toll-like receptor 2(TLR2)and TLR4［J］.Infect Immun，2014 ，82(10):4127-4134.

［8］Park CH，Abramson ZR，Taba JM Jr，et al.Three-dimensional micro-computed tomographic imaging of alveolar bone in experimental bone loss or repair［J］.J periodontol，2007，78(2):273-281.

［9］Hildebrand T，Laib A，Müller R，et al.Direct three-dimensional morphometric analysis of human cancellous bone:microstructural data from spine，femur，Iliac crest，and calcaneus［J］.J Bone Miner Res，1999，14(7):1167-1174.

［10］Zhu F，Sarkar S，Kaitwatcharachai C，et al.Methods and reproducibility of measurement of resistivity in the calf using regional bioimpedance analysis［J］.Blood Purif，2003，21(1):131-136.

［11］Kohler T，Beyeler M，Webster D，et al.Compartmental bone morphometry in the mouse femur:Reproducibility and resolution dependence of microtomographic measurements［J］.Calcif Tissue Int，2005，77(5):281-290.

［12］David W，Holdsworth，Michael M，et al.Micro-CT in small animal and specimen imaging［J］.Trends in Biotechnology，2002，20(8):S34-S39.

［13］Mary L Bouxsein，Stephen K Boyd，Blaine A Christiansen，et al.Guidelines for Assessment of Bone Microstructure in Rodents Using Micro-Computed Tomography［J］.J Bone Miner Res，2010，25(7):1468-86.

［14］Bonnet N，Laroche N，Vico L，et al.Assessment of trabecular bone microarchitecture by two different X-ray microcomputed tomographs:a comparative study of the rat distal tibia using Skyscan and Scanco devices［J］.Med Phys，2009，36(4):1286-1297.

［15］Waarsing JH，Day JS，Weinans H.An improved segmentation method for in vivo microCT imaging［J］.J Bone Miner Res，2004，19(10):1640-1650.

［16］Kuhn JL，Goldstein SA，F(xiàn)eldkamp LA，et al.Evaluation of a microcomputed tomography system to study trabecular bone structure［J］.J Orthop Res，1990，8(6):833-842.

［17］Müller R，Van Campenhout H，Van Damme B，et al.Morphometric analysis of human bone biopsies:a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography［J］.Bone，1998，23(1):59-66.

［18］Fanuscu MI，Chang TL.Three-dimensional morphometric analysis of human cadaver bone:microstructural data from maxilla and mandible［J］.Clin Oral Implants Res，2004，15(2):213-218.

［19］Chappard D，Retailleau-Gaborit N，Legrand E，et al.Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT［J］.J Bone Miner Res，2005，20(7):1177-1184.

［20］Akhter MP，Lappe JM，Davies KM，et al.Transmenopausal changes in the trabecular bone structure［J］.Bone，2007，41(1):111-116.

［21］Lu SH，Huang RY，Chou TC.Magnolol ameliorates ligature-induced periodontitis in rats and osteoclastogenesis:in vivo and in vitro study［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013:634095.

［22］Sartori R，Li F，Kirkwood KL.MAP kinase phosphatase-1 protects against inflammatory bone loss［J］.J Dent Res，2009，88(12):1125-1130.

［23］Aghaloo TL，Kang B，Sung EC，et al.Periodontal disease and bisphosphonates induce osteonecrosis of the jaws in the rat［J］.J Bone Miner Res，2011，26(8):1871-1882.

［24］Suda N，Moriyama K，Ganburged G.Effect of Angiotensin II receptor blocker on experimental periodontitis in a mouse model of Marfan syndrome［J］.Infect Immun，2013，81(1):182-188.

［25］Wilensky A，Gabet Y，Yumoto H，et al.Three-dimensional quantification of alveolar bone loss in Porphyromonas gingivalisinfected mice using micro-computed tomography［J］.J Periodontol，2005，76(8):1282-1286.

［26］Tokunaga K，Seto H，Ohba H，et al.Topical and intermittent application of parathyroid hormone recovers alveolar bone loss in rat experimental periodontitis［J］.J Periodontal Res，2011，46(6):655-662.

［27］Guimar?es MR，Coimbra LS，de Aquino SG，et al.Potent antiinflammatory effects of systemically administered curcumin modulate periodontal disease in vivo［J］.J Periodontal Res，2011，46(2):269-279.

［28］Trombetta-Esilva J，Yu H，Arias DN，et al.LPS induces greater bone and PDL loss in SPARC-null mice［J］.J Dent Res，2011，90(4):477-482.

［29］Bak EJ，Park HG，Kim M，et al.The effect of metformin on alveolar bone in ligature-induced periodontitis in rats:A pilot study［J］.J Periodontol，2010，81(3):412-419.

［30］Wilensky A，Gabet Y，Yumoto H，et al.Three-dimensional quantification of alveolar bone loss in Porphyromonas gingivalisinfected mice using micro-computed tomography［J］.J Periodontol，2005，76(8):1282-1286.

［31］潘建平，李治.基于遙感分類與數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的道路信息提?。跩］.計(jì)算機(jī)工程與應(yīng)用，2010，46(34):213-214，227.

［32］肖大雪.淺析數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)在圖像處理中的應(yīng)用［J］.科技廣場，2013，5:10-19.