巫翟，夏忠勝，鐘娃，盧錫基，于濤，陳其奎(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120)

Wip1基因沉默對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性的影響

巫翟，夏忠勝△，鐘娃，盧錫基，于濤，陳其奎
(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120)

目的:觀察靶向Wip1基因的特異性siRNA序列對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞Wip1基因的抑制效應(yīng)，探討Wip1基因沉默對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性的影響。方法:將Wip1-811 siRNA轉(zhuǎn)染入Wip1高表達(dá)的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株，采用real-time PCR法檢測(cè)Wip1 mRNA的表達(dá)，采用Western blotting方法檢測(cè)Wip1蛋白表達(dá)，采用MTS方法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。結(jié)果:Wip1-811 siRNA明顯抑制Wip1的表達(dá)。抑制Wip1基因表達(dá)后，轉(zhuǎn)染組RKO結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性增加，5-氟尿嘧啶處理組RKO結(jié)腸癌細(xì)胞活力由(89.4±6.6)%降至(74.7±3.9)%(P＜0.05)，奧沙利鉑處理組細(xì)胞活力由(77.9±2.4)%降至(66.7±2.9)% (P＜0.05)。轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA后，5-氟尿嘧啶處理組細(xì)胞凋亡比例由(7.7±0.5)%升至(12.3±3.2)% (P＜0.05);奧沙利鉑處理組細(xì)胞凋亡比例由(14.7±2.1)%升至(34.0±2.1)%(P＜0.05)。結(jié)論:沉默Wip1基因表達(dá)能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的化療敏感性。

結(jié)腸癌;小干擾RNA;Wip1基因;化療敏感性

［ABSTRACT］AIM:To observe the inhibitory effectof siRNA targeting to Wip1 gene on the Wip1 gene expression in the colon cancer cells and to investigate the influence of Wip1 gene silencing on the chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.METHODS:Wip1-811 siRNA targeting to Wip1 genewas transfected into RKO colon cancer cellswith high expression of Wip1 gene.ThemRNA expression ofWip1 wasmeasured by real-time PCR.The protein level of Wip1 was detected by Western blotting.The viability of RKO colon cancer cellswasmeasured by MTSassay.The cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.RESULTS:Wip1-811 siRNA efficiently inhibited the expression of Wip1 at mRNA and protein levels.The enhanced chemotherapy sensitivity of RKO colon cancer cellswas observed after inhibition of Wip1 gene expression.The viability of RKO colon cancer cellswas decreased from(89.4±6.6)%to(74.7±3.9)%after treated with 5-fluorouracil(P＜0.05)and decreased from(77.9±2.4)%to(66.7±2.9)%after treated with oxaliplatin(P＜0.05).The cell apoptotic rate was increased from(7.7±0.5)%to(12.3±3.2)%and from(14.7± 2.1)%to(34.0±2.1)%when RKO colon cancer cells were treated with 5-fluorouracil and oxaliplatin，respectively (P＜0.05).CONCLUSION:Wip1 gene silencing enhances chemotherapy sensitivity of colon cancer cells.

［KEY WORDS］Colon cancer;Small interfering RNA;Wip1 gene;Chemotherapy sensitivity

結(jié)腸癌是消化道常見腫瘤。在中國，近20年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷上升。根據(jù)2013年統(tǒng)計(jì)資料，結(jié)腸癌的發(fā)病率已達(dá)29/100 000，僅次于肺癌及胃癌;死亡率近14/100 000，位居腫瘤死亡率排名第5位。結(jié)腸癌已成為越來越嚴(yán)重的影響社會(huì)健康的問題。大部分結(jié)腸癌患者就診時(shí)已發(fā)展至中晚期，單純外科治療無法達(dá)到理想的治療效果。外科手術(shù)后輔以化療可以使結(jié)腸癌患者術(shù)后總的5年生存率提高10%～15%;對(duì)于腫瘤細(xì)胞全身轉(zhuǎn)移無法手術(shù)的患者，化療可以延長結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間，并可使部分無法手術(shù)切除的病灶變?yōu)榭墒中g(shù)治療病灶。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奧沙利鉑(oxali-platin)是治療結(jié)腸癌最主要的2種一線藥物，基于這2種藥物的FOLFOX化療方案被廣泛采用，但其臨床有效率只有50%，導(dǎo)致治療失敗的原因主要是結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥性。以往的研究采用了各種方法來逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性，包括應(yīng)用鈣離子拮抗劑、反義寡核苷酸及針對(duì)耐藥蛋白的siRNA［1］等，但這些方法療效有限，且一些方法還存在不良反應(yīng)。因此，仍有待尋找新的措施來逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性。

Wip1是一種原癌基因，其編碼的Wip1蛋白屬于2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族。Wip1是一種單體酶，在2價(jià)陽離子(鎂離子、錳離子)的催化下能直接使p53下游蛋白發(fā)生去磷酸化而失活，抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及受損細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡等功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究通過RNA干擾技術(shù)，體外對(duì)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向Wip1基因的siRNA，探討轉(zhuǎn)染靶向Wip1基因的siRNA后，結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性是否增強(qiáng)，從而有望為逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性提供一種新的方法。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;胎牛血清購自BioInd;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco;小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)序列Wip1-811 siRNA及陰性對(duì)照序列由中國蘇州吉瑪公司合成;Opti-MEM?I無血清培養(yǎng)基和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Life Technologies;RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光預(yù)混試劑SYBR Premix Ex TaqTM(含SYBR Green熒光染料及PCR反應(yīng)體系底物及酶)購自TaKaRa;PCR擴(kuò)增引物由Takara合成。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑Cocktail和Western blotting制膠試劑購自北京康為世紀(jì)公司;兔抗人Wip1多克隆抗體購自GeneTex;兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Bioworld Technology;山羊抗兔HRP-IgG購自Earth-Ox;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自Thermo;5-FU和奧沙利鉑化療藥物購自中國大連美侖生物公司;MTS試劑盒購自Promega;流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)用抗體購自BD。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中生長3 d后傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分別按每孔1×104、5×104和2 ×105的標(biāo)準(zhǔn)接種培養(yǎng)于96孔、24孔和6孔板用于實(shí)驗(yàn)。

2.2siRNA的合成及轉(zhuǎn)染根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Wip1基因序列(NCBI基因序列號(hào)8493)和siRNA設(shè)計(jì)原則，由蘇州吉瑪公司設(shè)計(jì)合成Wip1特異性siRNA鏈。siRNA序列(Wip1-811 siRNA)、陽性對(duì)照(GAPDH)siRNA及陰性對(duì)照siRNA序列由蘇州吉瑪公司合成。Wip1-811 siRNA的正義序列為5’-GGGUGGUUCUUGGAAUUCATT-3’，反義序列為5’-UGAAUUCCAAGAACCACCCTT-3’。采用LipofectamineTM2000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，取對(duì)數(shù)生長期的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞接種于24孔板，用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h至細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%后，棄去上清更換為Opti-MEM?I無血清培養(yǎng)基，Wip1-811 siRNA以50 nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞(轉(zhuǎn)染率80%)，未做任何處理的細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照(control)組，用LipofectamineTM2000處理的細(xì)胞設(shè)為脂質(zhì)體對(duì)照(liposome control)組，與人類基因無同源性序列的陰性siRNA序列處理組設(shè)為陰性對(duì)照(negative control)組，轉(zhuǎn)染6 h后更換普通培養(yǎng)基。根據(jù)是否用相應(yīng)濃度化療藥物處理，分為非藥物組(non-drug group)及化療藥物組(chemotherapy drug group)。分組后細(xì)胞進(jìn)行如下處理:(1)再培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞RNA，采用real-time PCR檢測(cè)Wip1 mRNA的表達(dá);(2)再培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞蛋白，采用Western blotting檢測(cè)Wip1蛋白的表達(dá);(3)再培養(yǎng)24 h后加入5-FU和奧沙利鉑(終濃度均為5μmol/L)處理48 h，MTS檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。

2.3Real-time PCR采用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用Roche的LightCycler?480 Real-Time PCR擴(kuò)增儀，于20μL反應(yīng)體系中加入2μL的cDNA模板，0.4μL 10μmol/L的Wip1上游引物(5’-CAGGGAAACTTTACCAATGAA-3’)，0.4μL 10 μmol/L的Wip1下游引物(5’-ACGAACCAGGGCAGGTATAT-3’)，10μL SYBR Premix Ex TaqTM和7.2 μL的dH2O。采用18S rRNA作為內(nèi)參照，18S rRNA上游引物為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反應(yīng)條件為:95℃30 s;95℃5 s，60℃20 s，共40個(gè)循環(huán);60℃15 s。Wip1和18S rRNA擴(kuò)增片段長度分別為180 bp和112 bp。通過PCR擴(kuò)增儀自帶的基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算程序，計(jì)算各組Wip1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，將陰性對(duì)照組Wip1 mRNA表達(dá)量設(shè)為1，通過與陰性對(duì)照組相比，比較各實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)情況。

2.4Western blotting檢測(cè)Wip1蛋白表達(dá)生長于6孔板的細(xì)胞去培養(yǎng)液，用冷PBS洗2次，每孔細(xì)胞加入裂解混合液100μL(91μL RIPA+9μL 10× cocktail)，置于冰上裂解30 min后，細(xì)胞刮刮凈板底將裂解液移至干凈EP管，超聲細(xì)胞儀碎裂細(xì)胞后，14 000×g、4℃離心20min，取上清。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。取40μg細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，5%濃縮膠70 V恒壓電泳至分界線，10%分離膠100 V恒壓電泳至膠底。200 mA 90 min恒流電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉90 min，4℃孵育I抗(Wip1 I抗1∶1 000稀釋，GAPDH I抗1∶1 000稀釋)過夜。次日TBST洗膜4次，每次10 min，加入II抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶5 000稀釋)室溫孵育60 min，再用TBST洗膜4次，每次5 min，加入ECL發(fā)光液曝光顯影。采用Image-Pro plus 6.0對(duì)Western條帶進(jìn)行灰度分析，Wip1蛋白條帶灰度值除以相應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值得出各組Wip1蛋白的相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力對(duì)數(shù)生長期RKO細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104，培養(yǎng)24 h后將Wip1-811 siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞并調(diào)整siRNA的終濃度為50 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入5-FU及奧沙利鉑(終濃度均為5μmol/L)處理48 h，采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活力。96孔板每孔細(xì)胞(含200μL培養(yǎng)基)加入20μL MTS試劑后，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，室溫振蕩5 min，在酶標(biāo)儀上讀取570 nm波長的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)共分為4組，未做任何處理的細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組，用LipofectamineTM2000處理的設(shè)為脂質(zhì)體對(duì)照組，與人類基因無同源性序列的siRNA序列處理組設(shè)為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA組設(shè)為轉(zhuǎn)染組。其中每一組細(xì)胞中未加入化療藥物處理的細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照孔，其細(xì)胞活力記為1，通過與空白對(duì)照孔比較計(jì)算其余加入藥物處理的細(xì)胞活力。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期按前文所述處理好各組細(xì)胞后，用胰酶將細(xì)胞消化、重懸并轉(zhuǎn)移至流式離心管，PBS洗2次后將細(xì)胞分為2管。一管用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，加入5μL Annexin V及200μL 1×binding buffer緩沖液制成細(xì)胞數(shù)約1×109/L細(xì)胞懸液，避光反應(yīng)30 min，加入10μL PI上機(jī)檢測(cè);另一管用于檢測(cè)細(xì)胞周期，加入200μL PBS重懸細(xì)胞后用2 mL 70%冰凍乙醇固定細(xì)胞，次日處理后上機(jī)檢測(cè)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組之間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)或q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1Wip1-811 siRNA抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞W ip1 mRNA和蛋白的表達(dá)

圖1顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、陰性對(duì)照組之間Wip1的mRNA表達(dá)無明顯差異，siRNA轉(zhuǎn)染組Wip1的mRNA表達(dá)水平明顯低于另外3組，轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組相比，Wip1的mRNA表達(dá)量降低約4倍，差異顯著(P＜0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染組Wip1蛋白表達(dá)水平明顯低于另外3組，進(jìn)一步灰度分析結(jié)果表明，Wip1-811 siRNA組蛋白的相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組降低約4倍，差異顯著(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Influence of Wip1-811 siRNA on the protein expression ofWip1 in RKO colon cancer cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs negative control.圖2　Wip1-811 siRNA對(duì)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞W ip1蛋白表達(dá)的影響

2Wip1-811 siRNA增強(qiáng)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性

表1顯示，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA不能抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的生長(P＞0.05)，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、陰性對(duì)照組及siRNA轉(zhuǎn)染組中5-FU及奧沙利鉑均能明顯降低結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生長活力，差異顯著(P＜0.05);應(yīng)用化療藥物后，與另外3組對(duì)比，轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生長活力下降更為顯著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表達(dá)后結(jié)腸癌RKO細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性增加。

表1　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA后用抗腫瘤藥處理的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞的活力Table 1.The viability of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean± SD.n=9)

3抑制Wip1基因表達(dá)增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5-FU及奧沙利鉑能誘導(dǎo)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.05);應(yīng)用化療藥物后，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞比例明顯上升，差異顯著(P＜0.05)，表明抑制Wip1基因表達(dá)能增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，見圖3、4。

4Wip1基因表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA對(duì)細(xì)胞周期影響與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5-FU阻滯結(jié)腸癌RKO細(xì)胞于G0/G1期，與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例上升，S期相應(yīng)降低，差異顯著(P＜0.05);奧沙利鉑將結(jié)腸癌RKO細(xì)胞阻滯于G2/M期，與對(duì)照組相比，G2/M期細(xì)胞比例上升，差異顯著(P＜0.05)，沉默Wip1基因表達(dá)后，細(xì)胞周期比例無明顯改變(P＞0.05)，表明Wip1基因表達(dá)不影響5-FU及奧沙利鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變，見圖5、6和表2。

討論

p53在眾多的抑癌基因中是最重要的抑癌基因，p53的突變和功能滅活發(fā)生于半數(shù)以上的人類腫瘤中，完整的p53是阻止癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵。Wip1是抑制p53功能的主要因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Wip1能直接或間接使包括p53、p38 MAPK、ATM、CHK1、CHK2、MDM2和UNG2在內(nèi)的至少7種靶蛋白去磷酸化［2-3］，引起P53蛋白降解。新研究報(bào)道誘導(dǎo)Wip1高表達(dá)可以抑制p16基因［4］，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，Wip1已成為促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

Figure 3.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+5-FU.圖3　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.Influence ofWip1-811 siRNA on the apoptosis of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs negative control+oxaliplatin.圖4　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with 5-FU.圖5　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA對(duì)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響

Figure 6.Influence ofWip1-811 siRNA on the cell cycle of RKO colon cancer cells treated with oxaliplatin.圖6　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響

結(jié)腸癌組織存在Wip1基因高表達(dá)，Wip1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分級(jí)相關(guān)，高表達(dá)水平Wip1基因提示較差的預(yù)后［5］。為進(jìn)一步明確Wip1在結(jié)腸癌中的作用，本研究設(shè)計(jì)靶向Wip1基因的siRNA并導(dǎo)入RKO結(jié)腸癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染組RKO細(xì)胞Wip1 mRNA及蛋白表達(dá)均較另外3組明顯降低，證明Wip1-811 siRNA能有效抑制Wip1基因表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ip1-811 siRNA對(duì)RKO細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期無明顯影響，而在應(yīng)用相同濃度化療藥物的情況下，轉(zhuǎn)染組RKO細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯低于另外3組，細(xì)胞凋亡比例較對(duì)照組顯著增加，細(xì)胞周期無明顯變化，提示低表達(dá)水平的Wip1基因能增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用，抑制Wip1基因表達(dá)能增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的化療敏感性。本研究證實(shí)了Wip1與結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性相關(guān)，但Wip1在其它結(jié)腸癌細(xì)胞株中是否表現(xiàn)出相同作用及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。部分研究者認(rèn)為下調(diào)Wip1基因表達(dá)可提高p53水平并直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，基于5-FU和奧沙利鉑方案的結(jié)腸癌化療患者，高表達(dá)水平的p53可以提高化療成功率，從而延長患者存活時(shí)間［6］;抑制Wip1基因能增加野生型P53蛋白的積聚，引起細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)增加，使S期細(xì)胞比例上升，從而提高細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［7］。但本研究結(jié)果表明抑制Wip1基因本身不能引起RKO結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡增加及細(xì)胞周期改變，仍需要從其它方面探討Wip1影響化療敏感性的可能。有研究認(rèn)為Wip1基因主要在細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激如損傷、炎癥、射線及藥物等過程中起作用，通過對(duì)磷酸化的p38 MAPK通路去磷酸化導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路的失衡，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯，降低藥物治療效果［8］。也有研究認(rèn)為Wip1是死亡相關(guān)蛋白6磷酸化關(guān)鍵的負(fù)反饋因素之一，高表達(dá)Wip1能抑制DNA損傷誘導(dǎo)的死亡相關(guān)蛋白6磷酸化，阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而增加細(xì)胞對(duì)刺激耐受性［9］。沉默Wip1基因可能對(duì)腫瘤干細(xì)胞自我增殖存在一定抑制作用，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的化療敏感性［10］。

表2　轉(zhuǎn)染W(wǎng) ip1-811 siRNA后用抗腫瘤藥處理的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分析Table 2.The cell cycle analysis of RKO colon cancer cells treated with antitumor drugs after transfection with Wip1-811 siRNA(%.Mean±SD.n=6)

本研究采用siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法成功沉默Wip1基因并證實(shí)低表達(dá)水平的Wip1增強(qiáng)RKO結(jié)腸癌細(xì)胞的化療敏感性，為解決結(jié)腸癌化療耐藥性提供了新的方法。然而，siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染存在基因抑制強(qiáng)度不理想、有效作用持續(xù)時(shí)間較短等不足之處，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀造成一定影響。本研究結(jié)果均由體外實(shí)驗(yàn)觀察得到，未來需要構(gòu)建Wip1-811 siRNA穩(wěn)定表達(dá)載體，在體內(nèi)外觀察Wip1-811 siRNA長期穩(wěn)定的RNA干擾效應(yīng)，并進(jìn)一步探討Wip1參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞化療敏感性的相關(guān)機(jī)制。

［1］夏忠勝，朱兆華，陳其奎，等.靶向MDR1基因的RNAi穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):898-903.

［2］Zhang C，Chen Y，Wang M，et al.PPM1D silencing by RNA interference inhibits the proliferation of lung cancer cells［J］.World JSurg Oncol，2014，12:258.

［3］Donehower LA.Phosphatases reverse p53-mediated cell cycle checkpoints［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2014，111(20):7172-7173.

［4］Yang D，Zhang H，Hu X，et al.Abnormality of p16/ p38MAPK/p53/Wip1 pathway in papillary thyroid cancer［J］.Gland Surg，2012，1(1):33-38.

［5］Li ZT，Zhang L，Gao XZ，et al.Expression and significance of theWip1 proto-oncogene in colorectal cancer［J］.Asian Pac JCancer Prev，2013，14(3):1975-1979.

［6］N?pel-Dünnebacke S，Schulmann K，Reinacher-Schick A，et al.Prognostic value ofmicrosatellite instability and p53 expression in metastatic colorectal cancer treated with oxaliplatin and fluoropyrimidine-based chemotherapy［J］.ZGastroenterol，2014，52(12):1394-1401.

［7］Bisteau X，Caldez MJ，Kaldis P.The complex relationship between liver cancer and the cell cycle:a story of multiple regulations［J］.Cancers(Basel)，2014，6(1): 79-111.

［8］Yu E，Ahn YS，Jang SJ，et al.Overexpression of the wip1 gene abrogates the p38 MAPK/p53/Wip1 pathway and silences p16 expression in human breast cancers［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，101(3):269-278.

［9］Brazina J，Svadlenka J，Macurek L，et al.DNA damageinduced regulatory interplay between DAXX，p53，ATM kinase and Wip1 phosphatase［J］.Cell Cycle，2015，14 (3):375-387.

［10］Zhang XL，Wan G，Mlotshwa S，et al.Oncogenic Wip1 phosphatase is inhibited by miR-16 in the DNA damage signaling pathway［J］.Cancer Res，2010，70(18):7176-7186.

Effect of Wip1 gene silencing on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells

WU Di，XIA Zhong-sheng，ZHONGWa，LU Xi-ji，YU Tao，CHEN Qi-kui
(Department of Gastroenterology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail:xiazhsh@163.com)

R543.1;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.016

1000-4718(2015)05-0857-07

2015-02-09［修回日期］2015-04-07

Tel:020-81332598;E-mail:xiazhsh@163.com