段忠心，劉興奎，喻田(遵義醫(yī)學院麻醉系，貴州遵義563003;南華大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽400)

二氮嗪后處理對離體大鼠心功能及線粒體心磷脂的影響*

段忠心1，2，劉興奎1△，喻田1
(1遵義醫(yī)學院麻醉系，貴州遵義563003;2南華大學附屬第二醫(yī)院麻醉科，湖南衡陽421001)

目的:建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，觀察二氮嗪(diazoxide，D)后處理對缺血/再灌注損傷離體大鼠心功能及線粒體心磷脂的影響，并探討ATP敏感性鉀通道在二氮嗪后處理心肌保護中的作用。方法:采用Langendorff裝置建立離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，將SD大鼠隨機分為對照組(control)、缺血再灌注模型組(I/R)、二氮嗪后處理組(I/R+D)、5-羥葵酸拮抗二氮嗪后處理組(I/R+5-HD+D)，每組8只，均先灌注平衡20 min。Control組:灌注平衡后續(xù)灌70 min;I/R組:缺血前灌注4℃ST.Thomas停跳液，全心缺血40 min，再灌30min;I/R+D組:全心缺血40min，缺血后給予含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液灌注5min后，再灌25min;I/R +5-HD+D組:二氮嗪后處理前給予含5-羥葵酸(100μmol/L)的K-H液灌注5 min，再灌20 min。觀察各組續(xù)(再)灌注末心率、冠脈流出液量、心功能、心肌酶學及心肌線粒體心磷脂的變化。結果:各組續(xù)(再)灌注末比較，I/R組較control組及I/R+D組心率減慢、冠脈流出液量降低，心功能明顯受損，心肌酶增加，心磷酯含量減少，但與I/R+5-HD+D無明顯差異。結論:二氮嗪后處理通過增加線粒體心磷脂含量，減少心肌酶的釋放，改善心臟功能，減輕心肌的再灌注損傷，產生心肌保護作用。5-羥葵酸能夠完全阻斷二氮嗪的心肌保護作用。

心磷脂;二氮嗪;缺血/再灌注損傷

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effect of diazoxide(D)postconditioning on Cardiac function and mitochondrial cardiolipin in isolated rat heart and to explore the protective effect of ATP sensitive potassium channel on diazoxide postconditioningmyocardium.METHODS:The myocardial ischemia/reperfusion injury model in isolated rat hearts was established by Langendorff apparatus.The isolated rat hearts were randomized into 4 groups(n=8):control group (control)，myocardial ischemia/reperfusion injury group(I/R)，diazoxide postconditioning group(I/R+D)，5-hydroxy decanoic acid(5-HD)plus diazoxide postconditioning group(I/R+5-HD+D).The hearts in each group were started with 20min perfusion for equilibration.The hearts in controlgroup perfused for70min;The hearts in I/R group was global ischemia for 40min after ischemia reperfusion at4℃ST.Thomas cardioplegia，then reperfusion for30min;The hearts in I/R+D group were treated with diazoxide(50μmol/L)in K-H perfusion for5 min after global ischemia for40 min，then reperfusion for 25 min;The hearts in I/R+5-HD+D group were treated with 5-HD(100μmol/L)in K-H perfusion for 5 min before diazoxide postconditioning，then reperfusion for 20 min.The heart rate，coronary outflow volume，heart function，myocardial enzymes and myocardialmitochondrial cardiolipin at the end of perfusion in each group were determined.RESULTS:Compared with control group and I/R+D group，the heart rate，the concentration of heart phospholipid and the coronary outflow volume were reduced，the heart function was significantly impaired the contents ofmyocardial enzymes were increased in I/R group.However，no significant difference between I/R group and I/R+5-HD+D group was ob-served.CONCLUSION:The diazoxide postconditioning protects the myocardium by increasing mitochondrial cardiolipin content，reducing the release ofmyocardial enzymes，improving heart function and reducingmyocardial reperfusion injury.Themyocardial protective effect of diazoxide is completely blocked by 5-hydroxy decanoic acid.

［KEY WORDS］Cardiolipin;Diazoxide;Ischemia/reperfusion injury

心肌線粒體內膜富含磷脂，作為膜磷脂雙層分子的基本結構之一，心肌缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)時含量明顯減少，與心臟IRI有著密切的聯系。Zhao等［1］在研究中發(fā)現并首先提出了缺血后處理(ischemic post-conditioning，IPO)可明顯減輕IRI。本實驗室的前期研究［2］表明，IPO通過激活線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)通道來保護心肌線粒體，從而產生心肌保護。隨后有大量研究證實IRI與mitoKATP有關［3］。本實驗進一步觀察二氮嗪(diazoxide，D)后處理對離體大鼠IRI線粒體心磷脂(cardiolipin，CL)的影響，探討二氮嗪后處理對心肌的保護機制。

材料和方法

1動物與實驗材料

健康清潔級雄性SD大鼠32只，16～20周齡，體重250～350 g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機分為4組:對照組(control)、缺血再灌注模型組(I/R)、二氮嗪后處理組(I/R+D)、5-羥基癸酸(5-hydroxydecanoic acid，5-HD)拮抗二氮嗪后處理組(I/R+5-HD+D)。

二氮嗪、CL及5-HD(Sigma);Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所);肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物技術研究所)。Langendorff離體心臟灌注裝置(PanLab);Powerlab/8SP實驗數據采集系統(tǒng)(AD Instrument);內切式高速均質器(IKA);HP-1100系列高效色譜分析儀(Agilent);色譜柱(編號C18B081203，中科院大連化物所)。其余試劑為國產分析純和色譜純。

2方法

2.1離體大鼠心臟模型的建立腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、肝素(250 U/kg)，麻醉后迅速劍突下沿著肋緣剪開腹壁，打開膈肌，沿著兩側腋前線剪開胸壁并上翻頭側，保留主動脈3～4 mm于心臟根部剪下心臟，立即放入預冷的K-H液(4℃)，輕輕擠壓心臟洗清殘留血液。液面下主動脈插管，固定置于Langendorff灌注管口。用37℃預先氧平衡的KH液心臟逆行灌注(灌注壓力75～85 mmHg)，心臟跳動后于左心耳剪一小口，將帶有乳膠水囊的測壓管經二尖瓣插入左心室，連接Powerlab/8SP生物機能試驗壓力換能器系統(tǒng)，調節(jié)水囊使LVEDP為4～8 mmHg。上述步驟均在2 min內完成。離體心臟用37℃的K-H液平衡灌注20 min，平衡后心率(heart rate，HR)＞250 min－1、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)＞85 mmHg、室性早搏＜2 min－1者納入實驗，未達條件者舍棄。

2.2灌注方案Control組平衡20 min后，續(xù)灌70 min;I/R組平衡20 min，灌注4℃ST.Thomas停跳液10 mL/kg，常溫下停跳后中斷灌注40 min，再次灌注37℃含氧的K-H液30 min;I/R+D組于缺血后主動脈分別逆灌含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液5 min、37℃含氧的K-H液25 min;I/R+5-HD+D組于缺血后主動脈分別逆灌含5-HD(100μmol/L)的K-H液持續(xù)5 min、含二氮嗪(50μmol/L)的K-H液5 min，再灌注37℃的K-H液20 min。

2.3心臟功能數據采集于續(xù)灌末或再灌注末采集心臟功能參數。記錄HR、左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)及左心室最高收縮壓(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)，計算左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)=LVPSP－LVEDP。

2.4冠脈流出液量及心肌酶學檢測標本的收集

各組予量筒收集并測量冠脈流出液量(coronary flow，CF)，留冠脈流出液2 mL，用于LDH及CK的檢測，具體方法按試劑盒說明進行。

2.5心肌線粒體提取參照文獻［3］方法，適當修改。各灌注終點取心臟后，立即將心臟在4℃線粒體分離液(10 mL/g心肌組織)中剪碎，內切式高速均質器勻漿(破碎頭8G，設置6，時間5 s)，600×g離心10 min，取上清液，3 600×g離心15 min取沉淀，取等量分離液將沉淀重新分散懸浮，1 000×g離心5 min，取上清液，5 500×g離心10 min，取沉淀，再次分散于適量分離液中。線粒體蛋白定量方法，參照Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書，用酶標儀測定A595，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。

2.6心肌線粒體總磷脂的提取參照Bligh等［4］方法，線粒體懸液按1∶(V/V)的比例加心磷脂提取液，混勻，靜置20 min，1 000×g離心3 min(4℃)，取下層，加1/5體積0.05 mol/L的氯化鈣旋轉混勻，靜置1 min，1 000×g離心10min，取下層氯仿相，在40℃的水浴箱中用氮氣吹至溶劑揮發(fā)殆盡，準確加入磷脂稀釋液0.1 mL，密閉、避光、液氮－80℃儲存待行高效液相色譜分析。除40℃的水浴箱外，其余過程均在0～4℃冰浴中進行，同時盡可能避光和隔絕空氣。線粒體CL含量測定參照Lesnefsky等［5］液相色譜法進行定性及定量:色譜系統(tǒng)為Agilent 1100系列高效液相色譜分析化學工作站(G1312A二元泵，G1313A自動進樣器，G1316A管柱控溫箱，G1315A二極管陣列檢測器);色譜柱為不銹鋼正相柱(Lichrosorb si60，5μm，4.6mm×250mm，中科院大連化物所，色譜柱編號C18B081203);淋洗條件為流動相流速1 mL/min，柱溫30℃，DAD檢測器，檢測波長206 nm，參考波長360 nm。定性分析用內標法，并以CL標準品在相同條件下的保留時間確定;定量分析以峰面積積分值記錄，用峰面積積分值轉換為CL量與線粒體蛋白含量之比表示CL含量(mg/g)。

3統(tǒng)計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1HR及CF的變化

I/R組較control組和I/R+D組HR減慢，CF降低(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無明顯差異，I/R+D組較control組的HR減慢，CF降低(P＜0.01);I/R組心功能明顯低于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無明顯差異，control組的心功能優(yōu)于I/R+D組(P＜0.01)，見表1。

表1　各組離體大鼠心臟HR、CF、LVEDP和LVDP的變化Table 1.The changes of the HR，CF，LVEDP and LVDP in the isolated rat heartswith different treatments(Mean±SD.n=8)

2心肌酶及心肌線粒體CL含量的變化

I/R組的心肌酶含量高于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無明顯差異，control組的心肌酶低于I/R+D組(P＜0.01);I/R組的CL含量低于control組和I/R+D組(P＜0.01)，但與I/R+5-HD+D組無明顯差異，control組的CL含量高于I/R+D組(P＜0.01)，見表2。

表2　各組離體大鼠心臟LDH、CK和心肌線粒體CL的變化Table 2.The changes of LDH，CK and CL in isolated rat hearts with different treatments(Mean±SD.n=8)

3高效液相色譜結果

在0.31μg～40μg線性良好，回歸方程為CL (μg)=0.003582×峰面積－0.7280(r=0.988);標準品最低檢測質量為0.15625μg(S/N≥3);日內及日間變異均＜7%，回收率＞69%，回收率及精密度見表3;溶劑色譜圖、CL標準品色譜圖及心肌線粒體磷脂色譜圖見圖1。

表3　CL高、中、低濃度的回收率和精密度Table 3.The recovery rate and precision of CL detected at high，moderate and light concentrations(Mean±SD.n=8)

Figure 1.The chromatogram ofmyocardialmitochondrial cardiolipin.圖1　心肌線粒體CL的色譜圖

討論

無論何種原因引起的心肌細胞損傷都會引起心肌酶不同程度的升高，心肌酶對于評價心肌損傷具有一定的敏感性和特異性。LDH是觀測缺血再灌注損傷的重要指標;CK是目前臨床上應用最為廣泛的心肌損傷標記物。本研究觀察冠脈流出液LDH及CK來判斷心肌損傷。HR、CF、LVDP及LVEDP的變化可直接反映心肌的損傷及收縮能力。本實驗結果表明二氮嗪后處理可顯著改善缺血心肌的收縮和舒張功能，使心輸出量增加，左室內壓升高，LVEDP下降，從而有效減輕IRI，減少心肌酶的釋放，產生心肌保護作用。5-HD能夠完全阻斷二氮嗪后處理對IRI的心臟保護功能。

線粒體膜是維持線粒體整體性與內外環(huán)境衡定的主要結構，是維護線粒體的電子傳遞、能量代謝及膜完整性必不可少的成分，其含量的降低影響內膜蛋白(陰離子轉運蛋白及呼吸鏈復合體)的功能，導致能量合成障礙，嚴重者導致心肌細胞死亡或凋亡。CL位于線粒體內膜，是線粒體內膜的特征性磷脂，緊密結合并支撐著線粒體呼吸鏈氧化酶及其它某些線粒體蛋白發(fā)揮功能，并與線粒體呼吸功能及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)關系密切［6］，CL減少導致活性氧生成增多，線粒體膜電位降低，導致細胞的凋亡［7］。IRI可使CL、卵磷脂、腦磷脂含量下降，以CL下降最明顯。Petrosillo等［8］認為CL為復合體Ⅲ提供反應界面，補充外源性CL則復合體Ⅲ的功能幾乎可以完全恢復，但是補充其它磷脂則不能恢復，表明只有保護CL才能維持呼吸鏈酶活性。近來研究發(fā)現，心肌IRI后線粒體呼吸功能受到抑制，電子傳遞受阻，ROS產生增加，而CL對ROS的攻擊特別敏感，ROS攻擊CL使復合體Ⅲ活性降低，電子漏增加，產生更多的ROS，導致線粒體CL含量下降，這種惡性循環(huán)最終導致細胞功能完全損害。細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)存在于膜間隙，它與CL通過非離子與線粒體的內膜結合，CL含量下降會導致Cyt C與內膜親和力下降，促進Cyt C釋放到胞質［9］，Cyt C漏出線粒體將使線粒體消除ROS的功能喪失，從而導致凋亡的發(fā)生。同時，脂質過氧化的中間產物還可使膜內蛋白質發(fā)生鏈式聚合作用，造成膜蛋白分子內和分子間交換，引起與CL密切相關的Cyt C氧化酶和三磷酸腺苷合成酶的活性降低，從而導致氧化磷酸化功能受損，細胞因能量供應障礙而死亡［10］。

本研究結果顯示，二氮嗪后處理能夠增加灌注末線粒體CL含量，保護和維持線粒體結構和功能的完整性而產生心肌保護作用。5-HD能夠阻斷二氮嗪后處理這一作用。其機制可能是增加CL含量，抑制3態(tài)呼吸活動、減少呼吸控制比率和磷氧比，4態(tài)呼吸活動的增加及抑制膜流動性的降低，使損傷呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯減輕［11］，減輕心肌線粒體氧化損傷，保護心肌線粒體，從而保護心肌。

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Effect of diazoxide postconditioning on cardiac function and m itochondrial cardiolipin in isolated rat heart

DUAN Zhong-xin1，2，LIU Xing-kui1，YU Tian1
(1Department of Anesthesiology，ZunyiMedical College，Zunyi563003，China;2Departmentof Anesthesiology，The Second Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang 421001，China.E-mail:xkliu@zmc.edu.cn)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.008

1000-4718(2015)05-0812-05

2014-07-23

2015-03-03

國家自然科學基金資助項目(No.30740044);貴州省科技基金資助項目［(2007)2121號］

Tel:0852-8608567;E-mail:xkliu@zmc.edu.cn