許澤芳+謝永興+郭樹源+趙翠+常維山

摘要： 本文主要對(duì)巴氏桿菌當(dāng)前比較流行的診斷技術(shù)進(jìn)行了匯總，并且引用了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的一些研究成果并進(jìn)行了分析。對(duì)該菌的分子生物學(xué)診斷技術(shù)的靈敏度和特異性進(jìn)行了介紹，對(duì)此病原菌的實(shí)驗(yàn)室研究提供了多種方法，最后展望了其分子生物學(xué)方法應(yīng)用于實(shí)踐的前景和存在的問題，為進(jìn)一步開展基礎(chǔ)研究提供了思路。

關(guān)鍵詞：巴氏桿菌;診斷技術(shù);應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S854.4 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2015）03-0038-04

巴氏桿菌?。≒astenrellosis）是由巴氏桿菌屬細(xì)菌引起畜禽共患的一種急性傳染病，主要是由多殺性巴氏桿菌引起，發(fā)生于各種家畜、家禽、野生動(dòng)物和人類的一種傳染病的總稱。本病為世界性分布，近年來，由于飼養(yǎng)環(huán)境惡劣、藥物的濫用、繼發(fā)感染或動(dòng)物機(jī)體自身的抵抗力低下等原因，巴氏桿菌的感染病例數(shù)量及感染物種不斷擴(kuò)大，關(guān)于野生動(dòng)物的病例報(bào)道也很多[1]?；疾?dòng)物急性病例往往以敗血癥和炎性出血過程為主要特征，慢性經(jīng)過時(shí)則表現(xiàn)為皮下組織、關(guān)節(jié)、各臟器的局灶性化膿性炎癥。在獸醫(yī)臨床上，以由多殺性巴氏桿菌感染引起的禽霍亂、豬肺疫、牛出血性敗血癥以及由溶血性巴氏桿菌某些亞型引起的羊的溶血性巴氏桿菌敗血癥等最為多見。

根據(jù)Bengey's 細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)，引起巴氏桿菌病的病原主要有 4種，即多殺性巴氏桿菌（P.multocida）、溶血性巴氏桿菌（P.heamolytica）、嗜肺巴氏桿菌（P.pneumotropica）和脲巴氏桿菌（P.ureae）等[2，3]。本屬細(xì)菌除致病作用和血清型不同外，其形態(tài)和培養(yǎng)特性幾乎完全一致。

應(yīng)用常規(guī)的診斷方法診斷巴氏桿菌雖然具有許多優(yōu)點(diǎn)， 但由于多殺性巴氏桿菌抵抗力不強(qiáng)，在直射陽光、干燥、無菌蒸餾水和生理鹽水中迅速死亡，且診斷時(shí)存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性低、漏診、誤診的缺點(diǎn)，應(yīng)該尋找新的診斷技術(shù)，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)為養(yǎng)殖戶挽回?fù)p失。隨著分子生物技術(shù)的不斷應(yīng)用和發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如核酸雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）、核苷酸序列分析和基因芯片等， 將在疾病的準(zhǔn)確、快速診斷中扮演重要角色。

1 ?病原學(xué)診斷

巴氏桿菌正常存在于多種健康動(dòng)物的口腔和咽部黏膜，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體抵抗力低下時(shí)，細(xì)菌容易侵入體內(nèi)，大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性傳染。因此掌握一些基本的診斷技術(shù)是相當(dāng)關(guān)鍵的，特別是依靠一些普通的實(shí)驗(yàn)微生物診斷技術(shù)尤為關(guān)鍵。

1.1 ?巴氏桿菌的分離培養(yǎng) ?分離培養(yǎng)可用患病動(dòng)物的組織、肝臟等新鮮病料，接種于鮮血瓊脂平板、馬丁氏血清瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和血清肉湯培養(yǎng)基等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高的培養(yǎng)基上，馬丁氏血清瓊脂平板上菌落微隆起、呈圓形、灰白色露滴狀，中等大小。在血瓊脂平板上長(zhǎng)成水滴樣小菌落，溶血性巴氏桿菌出現(xiàn)溶血，但多次傳代后溶血性也會(huì)消失，多殺性巴氏桿菌則無溶血環(huán)。在血清肉湯中培養(yǎng)，開始輕度渾濁，4～6h 后液體變清亮，管底部出現(xiàn)粘稠沉淀，震搖后不分散，表面形成菌環(huán)。巴氏桿菌在麥康凱瓊脂上生長(zhǎng)緩慢甚至不生長(zhǎng)，菌落為紅色。在本屬中，多殺性巴氏桿菌是危害畜、禽最為嚴(yán)重的一種，從患病的動(dòng)物體液或組織中分離培養(yǎng)得到的菌落基本上分為兩種：一種為通過45°折光，在低倍顯微鏡下呈現(xiàn)鮮明的藍(lán)綠色而帶金光，邊緣有狹窄的紅黃色帶的Fg菌落型，相當(dāng)于血清型乙型。對(duì)小白鼠、家兔和豬毒力強(qiáng)大，每只注射活菌10～200個(gè)即可致死，而對(duì)家禽每只必須注射10個(gè)以上才可致死;另一種為在45°折光下，菌落呈現(xiàn)橘紅色，邊緣稍帶狹窄的黃綠光的FO菌落型，相當(dāng)于血清型甲型。對(duì)雞、鴿毒力強(qiáng)大，對(duì)豬的毒力較次，家兔對(duì)兩型的致死量無甚差異。在中國(guó)，牛、豬、驢和馬的多殺性巴氏桿菌病絕大多數(shù)為Fg型菌所致，家禽流行性巴氏桿菌病都是FO型菌所致。慢性病例中偶爾發(fā)現(xiàn)菌落較小、折光下呈現(xiàn)淡藍(lán)色的菌落。自病兔分離的菌落也都是FO型。

1.2 ?巴氏桿菌的染色與鏡檢 ?將患病動(dòng)物的組織滲出液、肝、脾、淋巴結(jié)、骨髓等新鮮組織涂片或制作成觸片，用瑞氏染色液或堿性美蘭液染色，五分鐘后放在油鏡下鏡檢，能夠發(fā)現(xiàn)典型的兩極濃染的短桿菌，即菌體兩端染色深，中間淺，無鞭毛，不形成芽孢，用印度墨汁等染料染色，可見清晰的莢膜，就可以初步診斷為巴氏桿菌感染。純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，可見紫紅色且兩端鈍圓的革蘭氏陰性球桿狀或短桿狀菌。

1.3 ?巴氏桿菌的生化試驗(yàn)鑒定 ?多殺性巴氏桿菌在48h內(nèi)可分解葡萄糖、果糖、單奶糖、蔗糖和甘露糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。一般不發(fā)酵乳糖、鼠李糖、菊糖、水楊苷和肌醇，可產(chǎn)生硫化氫，能形成靛基質(zhì)，M.R.和V-P試驗(yàn)均為陰性。接觸酶和氧化酶試驗(yàn)均為陽性。溶血性巴氏桿菌不產(chǎn)生靛基質(zhì)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，能發(fā)酵葡萄糖、糖元、肌醇、麥芽糖、淀粉;不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、菊糖和赤蘚醇。

1.4 ?動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ?可用病畜的病料乳劑制成1：10懸液，或用已制成的分離培養(yǎng)菌，皮下注射小鼠、家兔或鴿，動(dòng)物多在24～48h內(nèi)死亡。由于健康動(dòng)物呼吸道內(nèi)?？蓭Ь詰?yīng)參照病畜的生前臨床癥狀和剖檢變化、分離培養(yǎng)、生化特性作出最后診斷。

2 ?血清學(xué)診斷技術(shù)

若要鑒定莢膜抗原和菌體抗原型，則要用抗血清或單克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)動(dòng)物血清中的抗體，可用試管凝集、間接凝集、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)或 ELISA 等方法。

2.1 ?乳膠凝集試驗(yàn) ?在制好的巴氏桿菌乳膠液中滴加稀釋的免疫血清0.2～0.7ml，邊加邊搖，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的顆粒后，仍繼續(xù)加血清，直至顆粒消失，成為均勻的乳膠懸液為止。鏡下檢查應(yīng)無自凝。使用時(shí)，應(yīng)與一定稀釋度的相應(yīng)抗原出現(xiàn)陽性反應(yīng)，與生理鹽水出現(xiàn)陰性反應(yīng)為合格。同時(shí)以正常血清代替免疫血清進(jìn)行乳膠致敏，以作對(duì)照。endprint

取潔凈玻璃板一塊，用玻璃鉛筆劃成小格，滴加待檢樣品0.1ml，再滴加高免血清致敏乳膠0.01ml，以牙簽或火柴桿混勻，在3min內(nèi)判定結(jié)果。根據(jù)乳膠凝集的情況來判定。

2.2 ?酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） ?ELISA分為間接ELISA（i-ELISA）和競(jìng)爭(zhēng)ELISA（C-ELISA），可用于血清及乳汁樣本中巴氏桿菌的檢測(cè)，該法在國(guó)內(nèi)外均有商品化檢測(cè)試劑盒，國(guó)內(nèi)也有類似研究。

國(guó)外已報(bào)道用多殺性巴氏桿菌毒素（PMT）作為包被抗原建立檢測(cè)PMT抗體的ELISA方法，但PMT純化步驟復(fù)雜，其中的一些雜蛋白很難除盡，給推廣應(yīng)用帶來不便。盧順[4]等利用多殺性巴氏桿菌毒素基因的原核表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備單抗并利用酶標(biāo)單抗建立了單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA法用于檢測(cè)PMT抗體。李興玉等[5]通過提取豬巴氏桿菌菌株的莢膜和外膜蛋白抗原，首次建立了檢測(cè)豬巴氏桿菌病血清抗體的Dot-PPA-ELISA方法，確定了抗原的最佳包被濃度為7.76ul，酶標(biāo)SPA的最佳稀釋倍數(shù)為1：10。錢建飛等[6]應(yīng)用抗雞IgM單克隆抗體建立了檢測(cè)雞抗多殺性巴氏桿菌血清中特異性IgM抗體的抗體捕獲ELISA（Mac-ELISA），本法具有很高的特異性和良好的重復(fù)性。

3 ?DNA指紋技術(shù)

目前已有不少利用DNA指紋對(duì)多殺性巴氏桿菌分離株進(jìn)行分類的研究報(bào)導(dǎo)[7]。有人曾利用隨機(jī)引物PCR （AP-PCR）鑒別了豬呼吸道多殺性巴氏桿菌分離株和免疫火雞多殺性巴氏桿菌分離株。該技術(shù)是建立于RFLP基礎(chǔ)上的，具有高度的特異性和穩(wěn)定的遺傳性等優(yōu)點(diǎn)。然而這種方法需采用放射標(biāo)記來提高其檢測(cè)的靈感度，因此限制了該技術(shù)的應(yīng)用。該技術(shù)可用同位素標(biāo)記或者熒光素標(biāo)記方法從而使菌體基因組中富含某種核苷酸，大大提高了對(duì)擴(kuò)增片段檢測(cè)的靈敏度。國(guó)內(nèi)有人用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠的嗜肺性巴氏桿菌，結(jié)果表明，該法簡(jiǎn)便、快捷，具有事先不需要知道被檢菌的基因序列、對(duì)試驗(yàn)條件要求不嚴(yán)格等優(yōu)點(diǎn)。此外，基因組重復(fù)序列PCR （REP-PCR）指紋在鑒別鳥源和豬源多殺性巴氏桿菌分離株時(shí)具有比較高的鑒別能力。

4 ?基因芯片技術(shù)在巴氏桿菌診斷中的應(yīng)用

基因芯片技術(shù)能在單一檢測(cè)中從種、亞種、型和亞型水平上同時(shí)鑒定多種病原，為多病原聯(lián)合檢測(cè)和病原分型提供了一項(xiàng)新技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、高通量和平行性的優(yōu)點(diǎn)。它可將待鑒定病原的多個(gè)特征性基因片段固定于玻片等載體上制成檢測(cè)或鑒定芯片，不僅可利用PCR的敏感性和簡(jiǎn)便性，還能在一次試驗(yàn)中同時(shí)分析目標(biāo)微生物的多個(gè)基因，從而克服因PCR高敏感而引起的非特異性[8]。肖國(guó)生[9]等利用七個(gè)從胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌3種病菌基因組中擴(kuò)增出的不同特異性靶DNA制作成基因芯片，用來診斷三種細(xì)菌的感染。程亞樓[10]通過選擇16-23S rDNA 間區(qū)序列為靶序列，設(shè)計(jì)了6種特異性探針實(shí)現(xiàn)對(duì)多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和豬鏈球菌的鑒定。

5 ?其它PCR 技術(shù)在巴氏桿菌診斷中的應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)因具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)， 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)、遺傳病診斷等諸多領(lǐng)域。當(dāng)前PCR技術(shù)仍然是檢測(cè)巴氏桿菌的主要方法。而PCR檢測(cè)擴(kuò)增用引物大多根據(jù)Pm的16SrRNA和KMT基因設(shè)計(jì)[11，12]，經(jīng)Pm 16SrRNA和plpE基因的序列分析得知，Pm 16SrRNA與APP、HPS 16SrRNA序列相似性均達(dá)93%以上，所以根據(jù)Pm 16SrRNA建立的PCR存在不足之處。APP、HPS不含有plpE基因且不同血清型Pm plpE基因序列相似性在92%以上。黃海燕[13]等根據(jù)plpE基因是多殺性巴氏桿菌的特異保守基因這一特性，從而建立了以plpE基因?yàn)榛A(chǔ)的多殺性巴氏桿菌特異性PCR方法，并用該方法對(duì)來自四川的6個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的64份疑似多殺性巴氏桿菌感染的樣品進(jìn)行初步檢測(cè)，64份疑似樣品中的36份診斷為多殺性巴氏桿菌陽性，檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明以多殺性巴氏桿菌的plpE基因建立的PCR方法的可靠性和實(shí)用性。

2001年，Townsend等利用基因消減的方法對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了多殺性巴氏桿菌基因組上1個(gè)特有區(qū)域，針對(duì)該多殺性巴氏桿菌特異性DNA序列設(shè)計(jì)引物，所有的多殺性巴氏桿菌都可以擴(kuò) 增 出1個(gè)460bp的 片 段，即Pm-PCR[14]。Hricinova等建立了Pm、HPS和APP的多重PCR，檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌分離鑒定結(jié)果相符合[15]。2004年，Kamp等經(jīng)GenBank在線序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌的翻譯調(diào)節(jié)基因（Pm0762-Pm1231）不存在于其它任何細(xì)菌，由此建立的多殺性巴氏桿菌PCR檢測(cè)方法具有種屬特異性。Kamp等根據(jù)T+PM的毒素基因建立檢測(cè)T+PM的PCR，并證明其與ELISA結(jié)果相同[16]。

PCR技術(shù)以其特異性、敏感性、快速、簡(jiǎn)便和對(duì)標(biāo)本的純度要求低的優(yōu)點(diǎn)， 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)， 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)，尤其對(duì)培養(yǎng)困難的細(xì)菌檢測(cè)和抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)菌鑒定，具有常規(guī)方法無法比擬的優(yōu)越性。

6 ?展望

巴氏桿菌的分子生物學(xué)診斷方法具有診斷確實(shí)、靈敏度高、特異性強(qiáng)和診斷迅速等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此在日常生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前巴氏桿菌的分子生物學(xué)方法在科研工作中已經(jīng)得到一定的應(yīng)用。隨著人們對(duì)巴氏桿菌認(rèn)識(shí)的不斷深入，為預(yù)防和治療此病提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但是分子生物學(xué)方法對(duì)于確診也存在一定的誤差率，單獨(dú)使用一種方法的診斷效率往往不高，目前對(duì)于巴氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷和研究多是幾種實(shí)驗(yàn)方法聯(lián)合起來應(yīng)用，而不是單用其中的一種方法，例如常規(guī)方法與PCR 法連用、常規(guī)法與克隆表達(dá)的連用、ELISA- PCR法、PCR- DNA探針法等，這些方法的聯(lián)合使用使準(zhǔn)確率得到提高。但是分子生物學(xué)方法的應(yīng)用具有價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)，在實(shí)際診斷中仍以眼觀和剖檢為主，誤差率較大。應(yīng)大力研究分子生物學(xué)方法，降低生產(chǎn)成本，使其在不久的將來成為一種成熟的診斷技術(shù)。endprint

參考文獻(xiàn)：

[1] ?佟慶彬.東北虎巴氏桿菌病的病原分離鑒定及病理學(xué)觀察[D].吉林：吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，2005.

[2] ?楊本升，劉玉斌，茍仕金等主編.動(dòng)物微生物學(xué)[M].吉林：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，1995：456-467.

[3] ?鄧定華主編.人獸共患病學(xué)[M].北京：藍(lán)天出版社，1993：230-263.

[4] ?盧順，向敏，吳斌，等.檢測(cè)多殺性巴氏桿菌毒素抗體的單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，04：555-561.

[5] ?李玉興.利用Dot-PPA-ELISA 檢測(cè)豬巴氏桿菌病抗體的研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002.

[6] ?錢建飛，徐步，陳溥言，等.單抗捕獲ELISA法檢測(cè)禽多殺性巴氏桿菌特異性IgM抗體[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，01：64-71.

[7] ?Amonsin A， Wellehan J F， Li L L， et al. DNA Fingerprinting of Pasteurella multocida Recovered from Avian Sources[J]. Clin Microbiol， 2002， 40（8）： 3025～3031

[8] ?VOLOKHOV D， CHIZHIKOV V， CHUMAKOVK， et al. Microarray-based identification of ther-mophilic Campylobacter jejuni， C. coli， C. lari， and C. upsaliensis[J]. J Clin Microbiol， 2003， 41（9）：4071-4080.

[9] ?肖國(guó)生.胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌基因芯片檢測(cè)與分型研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[10] ?程亞樓.豬的六種常見致病菌基因芯片檢測(cè)技術(shù)的研究[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[11] ?亓英芳，劉家森，張?jiān)谄剑?巴氏桿菌PCR診斷方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，7：68-69.

[12] ?施少華，程龍飛，傅光華，等.檢測(cè)禽多殺性巴氏桿菌PCR方法的建立[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，24（3）：201-204.

[13] ?黃海燕，王印，彭娟，等.豬源多殺性巴氏桿菌PCR鑒定方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，07：1111-1116.

[14] ?TOWNSEND K M， BOYCE J D， CHUNG J Y， et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39： 924-929.

[15] ?HRICINOVA M， HOLODA E， MUDRONOVA D， et al. MULTIPLEX PCR assay for detection of Actinobacillus pleuropneumoniae， Pasteurella multocida and Haemophilus parasuis in lungs of pigs from a slaughterhouse[J]. Folia Microbiol， 2010， 55： 635-640.

[16] ?KAMP E M， BOKKEN G C， VERMEULEN T M， et al. A specific and sensitive PCR assay suitable for large-scale detection of toxigenic PCR assay suitable for large-scale detection of toxigenic Pasteurella multocida in nasal and tonsillar swabs specimens of pigs[J]. J Vet Diagn Invest， 1996， 8：304-309.endprint