校 搏 郝綏綏 吳鳳新 孟 潔 張 宇 劉 健 黃宇光顧 寧#* 許海燕#*

1 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730)2 (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)3 (東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210096)

磁響應(yīng)性三元復(fù)合材料制備及引導(dǎo)骨缺損修復(fù)的研究

校 搏1郝綏綏2吳鳳新2孟 潔2張 宇3劉 健2黃宇光1顧 寧3#*許海燕2#*

1(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院麻醉科，北京 100730)2(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)3(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物電子學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210096)

創(chuàng)傷、感染、腫瘤和先天畸形等均會(huì)造成骨組織的缺損，當(dāng)缺損超過臨界尺寸時(shí)，骨組織無法完成自我修復(fù)，應(yīng)用生物材料引導(dǎo)骨組織的再生從而修復(fù)缺損組織是極為重要的治療策略，而骨形成速度慢則是當(dāng)前引導(dǎo)骨再生支架面臨的難點(diǎn)之一。氧化鐵磁性納米顆粒(γ-Fe2O3-NP)和納米羥基磷灰石(nHA)與消旋聚乳酸(PDLLA)以不同比例共混，利用高壓靜電紡絲技術(shù)制備具有納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料薄膜。應(yīng)用振蕩樣品磁強(qiáng)計(jì)研究復(fù)合材料的磁學(xué)性質(zhì)與氧化鐵磁性納米顆粒含量之間的關(guān)系，通過掃描電鏡觀察薄膜材料的微觀結(jié)構(gòu)特征。選取12只健康雄性成年新西蘭大白兔，在橫突骨組織離斷模型上，采用CT成像技術(shù)，研究術(shù)后10、30、50 d時(shí)復(fù)合材料植入組、復(fù)合材料植入加磁場(chǎng)組以及離斷無治療對(duì)照組的骨組織再生與缺損修復(fù)效果；此外，在術(shù)后20 d采集每組中2只動(dòng)物的植入部位組織進(jìn)行病理觀察。研究結(jié)果顯示，復(fù)合材料具有超順磁響應(yīng)性質(zhì)，且隨材料中氧化鐵納米顆粒比例的提高而增強(qiáng)；該復(fù)合材料可以在外加磁場(chǎng)的作用下，加速引導(dǎo)離斷缺損部位的骨組織再生。

骨修復(fù)；氧化鐵磁性納米顆粒；復(fù)合材料；納米纖維支架

引言

創(chuàng)傷、骨疾病、腫瘤切除等，經(jīng)常會(huì)造成大塊骨缺損且很難自我修復(fù)。隨著社會(huì)快速發(fā)展與日益增加的人口老齡化，骨修復(fù)已成為臨床醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迫切需求，目前，骨科治療中通常使用自體骨或異體骨移植來治療大塊骨缺損，但是這些方法受到很多方面的限制，如來源有限、移植感染、免疫排斥反應(yīng)等[1-2]。過去數(shù)十年中，研究人員探索和開發(fā)了多種人工生物材料支架作為自體或同種異體骨移植的替代品，并取得了重要進(jìn)展，這些支架不僅具有良好的生物相容性和接近天然骨組織的微觀結(jié)構(gòu)，而且可以攜帶和緩釋骨形成蛋白等促進(jìn)骨形成的生物分子[3-6]。盡管如此，支架在體內(nèi)誘導(dǎo)成骨速度較慢而導(dǎo)致大塊缺損難以修復(fù)仍然是其面臨的巨大挑戰(zhàn)。

在正常生理?xiàng)l件下，骨組織感受由重力產(chǎn)生的負(fù)荷和由機(jī)體運(yùn)動(dòng)及體內(nèi)生理流體產(chǎn)生的剪切、擠壓與牽拉，通過將力刺激轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的功能和誘導(dǎo)骨的形成，以維持正常骨量和骨組織的最佳性能。例如，骨小梁受到的流體剪切應(yīng)力為0.8～3.0 N/m2，組織的應(yīng)變?yōu)?.03%～0.1%[7]。分析認(rèn)為，在骨缺損環(huán)境中，支架引導(dǎo)新骨形成速度緩慢的重要原因之一是植入初期支架與正常骨組織間還沒有形成緊密連接，因而無論是來自生理環(huán)境的力刺激還是體外施加的機(jī)械力，都難以有效傳遞到植入的支架上，所以支架中的成骨細(xì)胞在其增殖和向成骨分化的過程中缺少持續(xù)和適度的力刺激。因此，使支架在骨缺損部位給細(xì)胞以力學(xué)刺激是加速支架誘導(dǎo)成骨的一個(gè)關(guān)鍵因素。

一些研究結(jié)果表明，外加磁場(chǎng)能加速骨折的愈合[8]，如中等強(qiáng)度的靜磁場(chǎng)能促進(jìn)兔子的骨及軟骨的愈合[9]；而對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞施加磁刺激，可增加細(xì)胞液中游離鈣離子濃度，并將刺激信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)成骨細(xì)胞合成、分泌BMP等生長(zhǎng)因子[10]；此外，有報(bào)道說，將磁化的金屬材料植入到大鼠股骨中，可以預(yù)防骨密度下降[11]。近年來，國(guó)內(nèi)外均有研究組制備含磁性納米顆粒的復(fù)合材料支架，探究磁性顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的作用及其在骨缺損修復(fù)方面的應(yīng)用。例如，含有超順磁納米顆粒(MNP)的陶瓷復(fù)合物對(duì)人成骨細(xì)胞Ros17/2.8和MG63表現(xiàn)出良好的相容性，其中超順磁納米顆粒不影響骨形成蛋白(BMP)與復(fù)合物的結(jié)合，磁性Fe3O4納米顆粒與殼聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)的復(fù)合納米纖維膜也表現(xiàn)出促進(jìn)人成骨細(xì)胞(MG63)增殖的功能，含磁性氧化鐵顆粒的多孔生物活性玻璃支架(Fe-MBG)可提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的線粒體活性和骨相關(guān)基因(ALP和OCN)的表達(dá)[12-14]。本課題組曾經(jīng)報(bào)道，采用溶液混合方法，可制備含有氧化鐵磁性納米顆粒的納米纖維支架材料；在骨的部分缺損模型上，該支架可以響應(yīng)外加磁場(chǎng)的作用而對(duì)生長(zhǎng)在支架上的細(xì)胞產(chǎn)生力學(xué)刺激功能，從而加速新骨的形成[15-16]。

本研究在上述工作的基礎(chǔ)上，采用熱熔共擠出技術(shù)制備三元復(fù)合材料，研究了復(fù)合材料的磁學(xué)性質(zhì)與氧化鐵納米顆粒含量的關(guān)系，并在兔橫突骨組織離斷模型上，研究了在外加磁場(chǎng)條件下磁響應(yīng)性納米纖維復(fù)合材料引導(dǎo)骨缺損的修復(fù)作用。結(jié)果顯示，復(fù)合材料的超順磁響應(yīng)性質(zhì)隨材料中氧化鐵納米顆粒比例的提高而增強(qiáng)，該復(fù)合材料可以在外加磁場(chǎng)作用下加速引導(dǎo)離斷部位骨組織的再生和修復(fù)。

1 材料與方法

1.1原料、試劑、手術(shù)器械和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

消旋聚乳酸(Poly (DL-lactide))，簡(jiǎn)稱PDLLA購(gòu)自四川成都迪康公司，平均分子量為80 KD。羥基磷灰石納米粒子(hydroxyapate nanoparticles, nHA)購(gòu)自南京埃普瑞納米材料有限公司，純度為97%，粒徑為20 nm，低菌低重金屬03型。氧化鐵磁性納米顆粒(γ-Fe2O3-NP)由東南大學(xué)顧寧教授實(shí)驗(yàn)室合成，粒徑約為14 nm。二甲基乙酰胺(DMAc)、無水乙醇均為北京化工廠生產(chǎn)分析純?cè)噭?。雙抗(青霉素、硫酸鏈霉素)：1×D-Hank’s配制濃度為20萬U/mL的溶液，過濾除菌后分裝至EP管中，封口膜封口，-20 ℃保存。4%多聚甲醛4 ℃保存。

手術(shù)用器械主要包括骨科手術(shù)常規(guī)器械、骨刀、骨膜剝離子、咬骨鉗等。健康雄性成年新西蘭大白兔12只，體重2.5～3.0 kg，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2方法

1.2.1復(fù)合材料的制備

稱量PDLLA、nHA、γ-Fe2O3-NP等3種材料，按照不同比例混合均勻，通過加樣漏斗加入到熱熔擠出機(jī)中(Haake MiniLab Ⅱ (Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Germany)，在120 ℃下共混擠出，得到三元復(fù)合材料。將復(fù)合材料溶于DMAc中，制成20%(W/V)PDLLA/DMAc溶液，灌注于5 mL的注射器中，針頭與高壓靜電發(fā)生器輸出端連接，針頭與接收屏(鋁箔)的距離20 cm，施加電壓20 kV，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)鋁箔接收針頭噴射出的絲束，得到電紡絲薄膜材料，放入真空干燥箱中，常溫下干燥48 h，徹底除去薄膜上殘留的有機(jī)溶劑，之后在純凈水中揭下薄膜。部分薄膜用于理化性質(zhì)表征和磁學(xué)性質(zhì)測(cè)定；其余材料折疊成質(zhì)量相同的塊狀材料，用于動(dòng)物骨缺損植入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2復(fù)合材料表征和磁學(xué)性質(zhì)測(cè)定

采用掃描電鏡(FEI nova nanosem 450)觀察電紡絲薄膜的微觀結(jié)構(gòu)。用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(Vibrating sample magnetometer，VSM)測(cè)量電紡絲薄膜的磁化曲線和磁滯回線，從中得出樣品的飽和磁化強(qiáng)度MS。

1.2.3動(dòng)物骨缺損模型及材料植入實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物稱重，耳緣靜脈緩慢注射3%戊巴比妥納/生理鹽水溶液(3 mg/kg)麻醉，術(shù)中可視情況經(jīng)耳緣靜脈追加麻醉。待結(jié)膜反射消失后，以棉線將四肢固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，剪除髂骨手術(shù)區(qū)域及周圍的被毛，以碘伏消毒。背部和雙側(cè)髂骨常規(guī)消毒，鋪巾。

沿背部正中做5 cm縱切口，以手術(shù)節(jié)段L5～L6為中心。切開皮膚、皮下，逐層解剖到椎旁筋膜。止血。切開椎旁筋膜暴露L5、L6棘突，沿棘突中間右側(cè)向下鈍性分離肌肉，深度約為1. 5 cm處可見L5橫突。用咬骨鉗咬斷橫突距其根部約1 cm處的骨組織，造成橫突骨組織完全離斷，將復(fù)合材料填充至離斷部位。設(shè)離斷無治療組為對(duì)照(n=4)。對(duì)分離的筋膜進(jìn)行縫合，椎旁筋膜用1-0的Vicryl可吸收線縫合，皮下組織用兩層2-0 Vicryl可吸收線縫合。3-0尼龍線褥式縫合皮膚，傷口以碘伏消毒。術(shù)后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌注雙抗20萬U/次，1次/d，共3 d。術(shù)后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)法分為3組，放養(yǎng)于兔籠，自由活動(dòng)：材料植入組(在常規(guī)籠中飼養(yǎng)，n=4)，材料植入加磁場(chǎng)組(置于兩側(cè)固定了磁條的籠中飼養(yǎng)，n=4)，磁場(chǎng)強(qiáng)度為2.5～30 mT。

1.2.4病理觀察分析和CT造影

在材料植入術(shù)后10、30、50 d，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行CT掃描成像(Somatom Sensation 64, Siemens Medical Solutions, Forchheim, Germany)。其中，在材料植入術(shù)后20 d時(shí)，各組處死動(dòng)物2只，取植入材料部位及周圍骨組織，包石蠟塊，切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，觀察新骨形成和材料被吸收的情況。

1.2.5評(píng)價(jià)骨組織形成的速度

對(duì)骨缺損材料植入術(shù)后20 d的病理結(jié)果進(jìn)行骨基質(zhì)所占比例的分析，通過計(jì)算單位材料面積下骨基質(zhì)和血管所占比例，評(píng)價(jià)磁場(chǎng)環(huán)境對(duì)于順磁性納米纖維復(fù)合材料促進(jìn)骨組織形成的影響。對(duì)骨基質(zhì)或血管占組織總面積比例的計(jì)算遵循以下原則：

1)均在20倍物鏡下觀察；

2)當(dāng)材料面積較大時(shí)，選取多個(gè)視野作為興趣區(qū)域，以代表總體組織；

3)當(dāng)植入材料在組織切片上分散為多塊時(shí)，默認(rèn)體積相當(dāng)?shù)拿恳粔K為獨(dú)立組織，其中央的區(qū)域具有代表性，并作為興趣區(qū)域進(jìn)行計(jì)算；

4)計(jì)算組織的總面積時(shí)，邊緣以材料為界，不包括周圍包裹的成纖維細(xì)胞；

5)當(dāng)看到材料周圍存在血管結(jié)構(gòu)時(shí)，將此血管結(jié)構(gòu)的面積計(jì)算在內(nèi)。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)

電紡絲薄膜的宏觀面積可達(dá)700 cm2以上，材質(zhì)柔軟，有一定韌性(見圖1(a))，可以剪裁、卷繞或折疊成需要的形狀(見圖1(b))。薄膜具有納米纖維網(wǎng)絡(luò)特征的微觀結(jié)構(gòu)(見圖1(c))，纖維的直徑在100～300 nm范圍，纖維相互無規(guī)纏結(jié)，形成直徑數(shù)十微米的孔隙。納米纖維和微米尺度貫通孔隙構(gòu)成了三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖1 電紡絲薄膜材料的宏觀特征和微觀結(jié)構(gòu)。(a) 電紡絲材料的宏觀形貌照片；(b)電紡絲薄膜材料可以纏繞和折疊；(c)電紡絲薄膜材料的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Morphological characterizations of nanofibrous film. (a) The photograph of nanofibrous film; (b) Twisting and folding of nanofibrous film; (c) The representative SEM image of nanofibrous film.

2.2復(fù)合材料的磁學(xué)性質(zhì)

電紡絲薄膜材料的磁化曲線如圖2所示。由圖可見，當(dāng)施加外加磁場(chǎng)時(shí)，復(fù)合材料的磁感應(yīng)強(qiáng)度迅速增加并達(dá)到飽和，當(dāng)外加磁場(chǎng)撤去，復(fù)合材料隨即退磁，幾乎沒有出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象，磁化曲線為對(duì)稱的S型，表明該復(fù)合材料具有超順磁性。此外，隨著復(fù)合材料中氧化鐵納米顆粒的質(zhì)量百分比從1%逐步增加到5%，其磁響應(yīng)能力隨之增強(qiáng)，表現(xiàn)在磁飽和強(qiáng)度相應(yīng)增大。

圖2 電紡絲薄膜材料的磁學(xué)性質(zhì)。(a)氧化鐵納米顆粒含量不同的電紡絲薄膜材料的磁化曲線；(b)不同氧化鐵納米顆粒含量不同的電紡絲薄膜材料的飽和磁化強(qiáng)度Fig.2 Magnetic property of nanofibrous film. (a) Magnetization curve of nanofibrous with different proportions of iron oxide nanoparticles; (b) Saturation magnetization of nanofibrous film with different proportions of iron oxide nanoparticles

2.3病理學(xué)觀察

對(duì)植入順磁性納米纖維復(fù)合材料的骨缺損部位的病理組織切片進(jìn)行觀察，分析材料誘導(dǎo)骨基質(zhì)形成(見圖3)和血管形成(見圖4)的進(jìn)程。成骨過程分為成骨細(xì)胞增殖期、細(xì)胞外基質(zhì)成熟期及細(xì)胞外基質(zhì)鈣化期。材料植入離斷部位后，會(huì)隨著時(shí)間而逐漸被降解，由新骨基質(zhì)所代替，并建立新的血供系統(tǒng)。由圖3可見，術(shù)后20 d時(shí)，部分成骨細(xì)胞(箭頭)的胞質(zhì)顏色加深；與此同時(shí)，材料加磁場(chǎng)組的新骨組織更多(粗箭頭指示的淺粉色區(qū)域)，這意味著成骨細(xì)胞的合成分泌骨基質(zhì)的功能更強(qiáng)。此外，可以看到植入的支架材料更多被吸收，表現(xiàn)為棕色區(qū)域相對(duì)較少。從圖4可以看出，在材料加磁場(chǎng)組的植入部位，由內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管結(jié)構(gòu)相對(duì)較多，同樣棕色的材料區(qū)域相對(duì)較少。這些結(jié)果說明，在外加磁場(chǎng)的作用下，磁響應(yīng)性支架可以更快地引導(dǎo)血管結(jié)構(gòu)的形成，有利于在支架內(nèi)部形成新骨組織。

圖3 材料植入后20 d骨缺損部位組織的HE染色。(a)和(c)無磁場(chǎng)和施加磁場(chǎng)下的組織；(b)和(d)(a)和(c)中黑色方框區(qū)域的放大(細(xì)箭頭所指為單核巨噬細(xì)胞，粗箭頭所指為新形成的骨基質(zhì)，三角形所標(biāo)為成骨細(xì)胞)Fig.3 HE staining of pathological on day 20 after implantation. (a) and (c) Newly formed bone tissue without and with magnetic field; (b) and (d) The magnified area of (a) and (c), respectively (Arrow: macrophage cells, bold arrow: newly formed bone matrix, triangle: osteoblast cells)

圖4 材料植入20 d后骨缺損部位組織的HE染色。(a)和(c)無磁場(chǎng)和施加磁場(chǎng)下的組織；(b)和(d)(a)和(c)中黑色方框區(qū)域的放大(細(xì)箭頭所指為血管內(nèi)皮細(xì)胞，V所標(biāo)為血管結(jié)構(gòu))Fig.4 HE staining of pathological on day 20 after implantation. (a) and (c) Newly formed bone tissue without and with magnetic field; (b) and (d) The magnified area of (a) and (c), respectively (Arrow: endothelial cells, V: vascular structure)

2.4骨基質(zhì)和血管形成速度的半定量分析

通過對(duì)比材料植入后骨基質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)在相同時(shí)間點(diǎn)的形成程度，可以評(píng)價(jià)在外加磁場(chǎng)下磁響應(yīng)性支架誘導(dǎo)新骨組織形成的作用。

圖5為在施加磁場(chǎng)或無磁場(chǎng)條件下，材料植入20 d后在離斷部位形成的骨基質(zhì)、血管結(jié)構(gòu)占組織總面積的比例分析結(jié)果?？梢?，在施加磁場(chǎng)的條件下，骨基質(zhì)所占的比例為4.41%，而無磁場(chǎng)環(huán)境下骨基質(zhì)的比例為1.7%(見圖5(a))，骨離斷部位的植入材料中有更多的骨基質(zhì)形成，提示外加磁場(chǎng)與磁響應(yīng)性納米纖維復(fù)合材料協(xié)同作用，顯著促進(jìn)了骨組織的生成；同時(shí)，當(dāng)外加磁場(chǎng)存在時(shí)，植入的磁響應(yīng)性納米纖維復(fù)合材料支架中所形成的血管結(jié)構(gòu)比例也表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，提示有利于缺損部位血管的形成(見圖5(b))。

圖5 在施加磁場(chǎng)或無磁場(chǎng)條件下，材料植入20 d后在離斷部位形成的骨基質(zhì)、血管結(jié)構(gòu)占組織總面積的比例(隨機(jī)視野數(shù)n=12)。(a)骨基質(zhì)占組織總面積比例(*P<0.05)；(b)血管結(jié)構(gòu)占組織總面積比例Fig.5 The percentage of newly formed bone matrix and vascular structure in the total area of tissue sample post 20 days of implantation with or without magnetic field. (a) The percentage of bone matrix(*P<0.05); (b) The percentage of vascular structure

2.4骨離斷部位植入復(fù)合材料后影像學(xué)觀察

由圖6可見，術(shù)后10 d，材料組和材料加磁場(chǎng)組的離斷處均可見植入材料，皮質(zhì)密度較低；術(shù)后30 d，材料組和材料加磁場(chǎng)組的橫突骨組織缺損處的密度不均勻性升高，說明開始有新骨形成，但骨皮質(zhì)仍不連續(xù)；術(shù)后50 d，不論在磁場(chǎng)環(huán)境還是無磁場(chǎng)環(huán)境下，植入部位骨離斷處的骨組織密度仍有不均勻性增高，部分皮質(zhì)密度較低，但骨皮質(zhì)已經(jīng)連續(xù)，說明支架已經(jīng)誘導(dǎo)新骨，將離斷的兩端連接起來；而單純骨缺損組在術(shù)后50 d時(shí)，骨離斷處的密度仍顯示不均勻性升高，骨皮質(zhì)明顯不連續(xù)。由此表明，在橫突骨組織完全離斷的情況下，自我修復(fù)十分困難；而應(yīng)用磁響應(yīng)性納米纖維復(fù)合材料作為支架進(jìn)行修復(fù)，則會(huì)明顯加快新骨組織的生成和離斷部位的重建與修復(fù)。

圖6 橫突離斷條件下術(shù)后10、30、50 d CT結(jié)果(圖中白色箭頭所指為骨損傷部位)。(a)無植入對(duì)照組；(b)施加磁場(chǎng)植入組；(c)無磁場(chǎng)植入組Fig.6 CT images of the bone disarticulation post 10, 30 and 50 days implantation (Bone disarticulation sites pointed by white arrows). (a) Group untreated; (b) Group treated with materials with magnetic field; (c) Group treated with materials without magnetic filed

3 討論和結(jié)論

骨是力敏感組織，骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞均為具有骨傳導(dǎo)功能的效應(yīng)細(xì)胞。因此，在骨的再生和修復(fù)過程中，給予成骨細(xì)胞適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激，對(duì)于新骨的形成十分重要。筆者對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后認(rèn)為，植入體內(nèi)的磁響應(yīng)性復(fù)合材料與外源性磁場(chǎng)協(xié)同作用，不僅有利于成骨細(xì)胞的分化和促進(jìn)其分泌細(xì)胞外基質(zhì)，而且能夠促進(jìn)血管的生成，從而促進(jìn)新骨組織的形成。上述協(xié)同效應(yīng)近年來也被其他實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)報(bào)道，如以羥基磷灰石為主體的超順磁性支架在外源性磁場(chǎng)下促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[17]，多孔磁性羥基磷灰石支架在外加磁場(chǎng)下對(duì)細(xì)胞的早期增殖具有促進(jìn)作用[18]，聚乳酸與氧化鐵磁性納米顆粒的復(fù)合納米纖維支架在外加磁場(chǎng)下引導(dǎo)成骨細(xì)胞沿纖維定向排列生長(zhǎng)[19]。

此外，磁響應(yīng)性支架與外加磁場(chǎng)的協(xié)同作用也促進(jìn)其他種類細(xì)胞的生長(zhǎng)，如Sapir等將大孔隙超順磁性海藻酸鹽支架、無磁性海藻酸鹽支架分別與牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)14 d，并在前7 d均施加40 Hz、10～15 G外源性交變磁場(chǎng)，對(duì)照組則不施加外源性交變磁場(chǎng)；后7 d撤掉磁場(chǎng)與對(duì)照組均進(jìn)行正常培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性磁場(chǎng)協(xié)同超順磁性海藻酸鹽支架能夠明顯提高內(nèi)皮細(xì)胞的代謝活性，促進(jìn)其遷移和形成血管樣結(jié)構(gòu)的能力[20]。Liu等發(fā)現(xiàn)，超順磁性甘油磷酸化殼聚糖聚合物支架在外加磁場(chǎng)條件下，有利于施旺氏細(xì)胞的黏附和增殖，促進(jìn)其分泌與神經(jīng)末梢再生密切相關(guān)的細(xì)胞因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等[21]。Fuhrer等發(fā)現(xiàn)，超順磁性水凝膠支架聯(lián)合周期性外源性磁場(chǎng)(0.8 T)，能夠有效地誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)向軟骨分化，顯著提高硫酸化糖胺聚糖(AGA)的沉積，從而促進(jìn)軟骨生成[22]。

綜上所述，筆者提出如下機(jī)理假說：支架中磁性氧化鐵納米顆粒在外磁場(chǎng)的作用下，其磁矩由無序趨向于與磁場(chǎng)同向；由于與基體材料復(fù)合，磁場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的無數(shù)微小磁矩的趨向運(yùn)動(dòng)將使支架產(chǎn)生局部微振動(dòng)和微形變，使黏附在支架上的細(xì)胞受到牽拉或者扭曲作用，支架由此將外磁場(chǎng)的作用轉(zhuǎn)化為機(jī)械力并直接作用于細(xì)胞。這種協(xié)同效應(yīng)適用于引導(dǎo)多種組織修復(fù)，因此該性質(zhì)在生物材料支架引導(dǎo)組織再生方面可能具有普適性的促進(jìn)作用。

[1] Sun Kang, Tian Shaoqi, Zhang Jihua,etal. Anterior cruciate ligament reconstruction with BPTB autograft, irradiated versus non-irradiated allograft: a prospective randomized clinical study[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc， 2009,17(5):464-74.

[2] Shafiei Z, Bigham AS, Dehghani SN,etal. Fresh cortical autograftversusfresh cortical allograft effects on experimental bone healing in rabbits: Radiological, Histopathological and Biomechanical evaluation[J]. Cell Tissue Bank,2009,10:19-26.

[3] Li Xiaoming, Wang Lu, Fan Yubo,etal. Nanostructured scaffolds for bone tissue engineering[J]. J Biomed Mater Res A,2013,101(8): 2424- 2435.

[4] Lopa S, Madry H. Bioinspired scaffolds for osteochondral regeneration[J].Tissue Eng Part A,2014,20(15-16):2052-2076.

[5] Ko E, Cho SW. Biomimetic polymer scaffolds to promote stem cell-m ediated osteogenesis[J]. Int J Stem Cells,2013,6(2):87-91.

[6] Li Jianhua, Baker BA, Mou Xiaoning,etal. Biopolymer/Calcium phosphate scaffolds for bone tissue engineering[J]. Adv Healthc Mater,2014,3(4):469-484.

[7] Orr AW, Helmke BP, Blackman BR,etal. Mechanisms of mechanotransduction[J]. Dev Cell, 2006,10(1):11-20.

[8] 熊建衛(wèi), 戴閩. 靜電場(chǎng)對(duì)成骨細(xì)胞和骨組織影響的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際骨科學(xué)雜志, 2008,29(4): 260-261.

[9] Jaberi FM, Keshtgar S, Tavakkoli A,etal. A moderate- intensity static magnetic fields enhances repair of cartilage damage in rabbits [J]. Arch Med Res, 2011,42(4): 268-273.

[10] Brighton CT, Wang W. Seldes R,etal. Signal transduction in electrically stimulated bone cells[J]. J Bone Joint Surg Am, 2001,83(10):1514-1523.

[11] 閻啟昌. 靜磁場(chǎng)對(duì)骨組織影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,30(4): 258-260.

[12] Wu Yao, Jiang Wen, Wen Xiantao,etal. A novel calcium phosphate ceramic-magnetic nanoparticle composite as a potential bone substitute[J]. Biomed Mater, 2010,5(1):15001.

[13] Wei Yan, Zhang Xuehui, Song Yu,etal. Magnetic biodegradable Fe3O4/CS/PVA nanofibrous membranes for bone regeneration[J]. Biomed Mater,2011,6(5): 055008.

[14] Wu Chengtie, Fan Wei, Zhu Yufang,etal.Multifunctional magnetic mesoporous bioactive glass scaffolds with a hierarchical pore structure[J]. Acta Biomater, 2011,7(10): 3563-3572.

[15] Meng Jie, Zhang Yu, Qi Xiaojin,etal. Paramagnetic nanofibrous composite films enhance the osteogenic responses of pre-osteoblast cells[J]. Nanoscale,2010,2(12): 2565-2569.

[16] Meng Jie, Xiao Bo, Zhang Yu,etal. Super-paramagnetic responsive nanofibrous scaffolds under static magnetic field enhance osteogenesis for bone repairinvivo[J]. Sci Rep, 2013,3: 2655.

[17] Zeng Xiaobo, Hu Hao, Xie Liqin,etal. Magnetic responsive hydroxy- apatite composite scaffolds construction for bone defect reparation[J]. Int J Nanomedicine,2012,7:3365-3378.

[18] Panseri S, Cunha C, D’Alessandro T,etal. Magnetic hydroxyapatite bone substitutes to enhance tissue regeneration: evaluationinvitrousing osteoblast-like cells andinvivoin a bone defect[J]. PLoS One, 2012,7(6): e38710.

[19] Li Long, Yang Guang, Li Jinrong,etal. Cell behaviors on magnetic electrospun poly-D, L-lactide nanofibers[J]. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2014,34: 252-261.

[20] Sapir Y, Cohen S, Friedman G,etal. The promotion of in vitro vessel-like organization of endothelial cells in magnetically responsive alginate scaffolds[J]. Biomaterials,2012,33(16):4100-4109.

[21] Liu Zhongyang, Huang Liangliang, Liu Liang,etal. Activation of Schwann cells in vitro by magnetic nanocomposites via applied magnetic field[J]. Int J Nanomedicine. 2014,10:43-61.

[22] Fuhrer R, Hofmann S, Hild N,etal.Pressureless mechanical induction of stem cell differentiation is dose and frequency dependent[J]. PLoS One, 2013,8(11):e81362.

Magnetic Responsive Scaffolds Enhance Bone Repair in the Applied Magnetic Field

Xiao Bo1Hao Suisui2Wu Fengxin2Meng Jie2Zhang Yu3Liu Jian2Huang Yuguang1Gu Ning3#*Xu Haiyan2#*

1(Department of Anesthesia, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China)2(Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)3( School of Biological Science and Medical Engineering, State Key Laboratory of Bioelectroncs, Southeastern University, Nanjing 210096, China)

Bone tissue cannot accomplish self-healing in critical size bone defects resulted from trauma, infection, tumor and congenital malformation. Using biomaterials that induce bone tissue regeneration to repair bone defects is an extremely important therapeutic strategy. However, slow bone formation is one of the difficulties in biomaterial-induced bone regeneration. In this work, a magnetic responsive nanofibrous composite film was fabricated with poly lactide acid (PLA), hydroxyapatite nanoparticles (nHA) and γ-Fe2O3nanoparticles (γ-Fe2O3NP) using electrospinning technique. The film was folded into a 3D scaffold that suitable for implantation in bone defect sites. The relationship between magnetic properties of composite materials and the percentage of iron oxide magnetic nanoparticles was investigated using vibrating sample magnetometer (VSM). The microstructure of films was observed by scanning electron microscopy (SEM). The effect of magnetic responsive composites on inducing bone repair and regeneration in situ under an applied magnetic field was evaluated in bone transverse process disartitulation model of 12 healthy male New Zealand rabbits after 10,30,50 days implantation. Results indicate that the composite display a strong paramagnetic property and show a positive correlation with the proportion of iron oxide nanoparticles. In an applied magnetic field, the bone tissue regeneration in the disarticulation sites was accelerated with the guidance of the composite scaffold.

bone repair, iron oxide magnetic particles, composite, nanofibrous scaffold

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.010

2015-03-20， 錄用日期:2015-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81471793)

R318

A

0258-8021(2015) 03-0330-07

# 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)會(huì)員(Member, Chinese Society of Biomedical Engineering)

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: guning@seu.edu.cn；xuhy@pumc.edu.cn