李德利 李箐 王 彤 毋育偉盧松鶴 胡洪成 唐志輝

1(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院第二門診部，北京 100012)2(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心，北京 100081)3(口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

兩種生物活性植骨材料對小鼠骨髓干細(xì)胞增殖和分化的影響

李德利1?李箐2,3?王 彤1毋育偉1盧松鶴1胡洪成1唐志輝3*

1(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院第二門診部，北京 100012)2(北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)數(shù)字化研究中心，北京 100081)3(口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

生長因子作用于拔牙后的牙槽窩，有可能阻止或減少牙槽骨的破壞吸收，從而維持牙槽骨原有的結(jié)構(gòu)。為了奠定臨床拔牙后、牙槽嵴位點(diǎn)保留的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本研究首先通過乳液交聯(lián)法合成殼聚糖微球，負(fù)載生長因子BMP-2及脂聯(lián)素(APN)，再將其復(fù)合于小牛松質(zhì)骨支架形成生物活性植骨材料。將兩種生物活性材料與小鼠前成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)共培養(yǎng)，比較材料對細(xì)胞增殖和分化的影響。結(jié)果表明，負(fù)載BMP-2的緩釋微球表面更為光滑，微球平均直徑為9.634 μm。cck-8結(jié)果表明，隨著BMP-2濃度的增加，細(xì)胞增殖速度較脂聯(lián)素組增加更快。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，ALP、BMP-2、OCN和Adipor2基因在APN處理組增加倍數(shù)高于BMP-2組。Western-Blot結(jié)果表明，APN植骨材料更有利于小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和分化。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)；脂聯(lián)素(APN)；成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)；藥物緩釋體系

引言

牙齒拔除后，拔牙窩周圍牙槽骨會(huì)發(fā)生持續(xù)性骨吸收，Araújo等的研究表明，拔牙后12個(gè)月內(nèi)牙槽嵴水平向骨吸收可高達(dá)5～7 mm，相當(dāng)于拔牙前牙槽骨寬度的一半[1]。其中大部分骨吸收發(fā)生在拔牙后3個(gè)月內(nèi)。有研究將骨替代材料或支架放入拔牙窩內(nèi)，為牙槽骨重建保留空間[2-5]，或在拔牙窩中應(yīng)用具有誘導(dǎo)成骨能力的生物活性因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)，雖然對促進(jìn)拔牙創(chuàng)的愈合并提高新骨形成的速度有一定的作用，但仍然無法阻止破骨細(xì)胞對牙槽骨壁的早期吸收破壞過程，僅能重建部分牙槽骨[6-8]。

骨重建是由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞共同介導(dǎo)的一種有序、平衡的骨吸收和骨形成過程[9-10]。因此，在骨破壞與骨生成的動(dòng)態(tài)平衡中，如果選擇既具有抑制破骨細(xì)胞活性，又能促進(jìn)成骨的生物因子作用于拔牙后的牙槽窩，將有可能能夠阻止或減少牙槽骨頰舌側(cè)骨板的破壞吸收，從而盡量維持牙槽嵴原有的框架結(jié)構(gòu)，減少因?yàn)檠啦酃侵亟ㄋ璧闹委煏r(shí)間、成本和手術(shù)難度。

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)在骨代謝中具有調(diào)控作用。成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞均表達(dá)脂聯(lián)素受體[11-12]，是脂聯(lián)素的靶器官。體外實(shí)驗(yàn)證明，脂聯(lián)素通過抑制TLR4介導(dǎo)的NF-kappa B激活，進(jìn)而抑制小鼠單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟[13]。另一方面，脂聯(lián)素通過激活A(yù)dipoRl/JNK、AdipoRl/p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞的增殖及分化，促進(jìn)其成骨功能[14]。體內(nèi)研究亦證實(shí)，含脂聯(lián)素的腺病毒轉(zhuǎn)染C57BL/6J小鼠后，破骨細(xì)胞功能被抑制，成骨細(xì)胞作用被激活，表現(xiàn)為凈骨量增加[15]。以上研究表明，脂聯(lián)素既能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，同時(shí)又能增加成骨細(xì)胞的活性和骨基質(zhì)的礦化。

本研究以高分子殼聚糖(chitosan, CS)作為緩釋載體，將生物活性因子脂聯(lián)素(adiponectin，APN)復(fù)合高溫煅燒的小牛松質(zhì)骨材料(ceramic bovine bone，CBB)，與 BMP-2復(fù)合CBB材料對照，探討兩種生物活性材料對小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和分化的影響，旨在構(gòu)建骨組織工程適宜的支架材料,為臨床拔牙后牙槽嵴位點(diǎn)保留奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1CBB制備

選用新鮮牛肱骨骨垢端松質(zhì)骨，截取3 mm×3 mm×15 mm形狀規(guī)則的長方形骨條，氫氧化鈉、雙氧水溶液浸泡后，高壓蒸煮2 h，去除部分蛋白及膠原，去離子水洗凈，烘干。將干燥的骨條放入馬弗爐中煅燒，緩慢升至700℃，氧氣氛圍2 h煅燒，形成保留自然骨架結(jié)構(gòu)的磷灰石骨架，將煅燒后的骨條浸入0.09 mol/L 焦磷酸鈉溶液中， 70℃水浴浸泡72 h，干燥后再將骨條再放入馬弗爐中煅燒， 緩慢升溫至1 200℃， 維持 1 h，制備成經(jīng)兩次煅燒的牛松質(zhì)骨塊。將煅燒骨塊研磨成顆粒，通過標(biāo)準(zhǔn)篩的標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)孔過濾，得到(0.25～1 mm)尺寸的煅燒骨顆粒。

1.2CS緩釋體系制備

采用乳化交聯(lián)法制備緩釋體系。稱取1.5 g殼聚糖溶于2.4 vol%的稀醋酸溶液60 mL中，待其完全溶解后，加入一定量的BMP-2/APN，機(jī)械攪拌使二者混合均勻。將混合后的溶液緩慢加入380 mL含2.7 wt%、2 wt%乳化劑Tween80、Span80的液體石蠟溶液中，室溫下機(jī)械攪拌3 h。然后向其中緩慢滴加的vanillin乙醇溶液，使殼聚糖發(fā)生交聯(lián)。滴加完畢，繼續(xù)攪拌6 h，靜置，取出沉淀物，用石油醚、異丙醇反復(fù)漂洗，最后將沉淀物冷凍干燥至恒重，分別制備出載BMP-2和APN的殼聚糖微球。

1.3CS/CBB支架材料的制備

室溫下將BMP-2/APN殼聚糖微球，配制1%或2%的殼聚糖溶液，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，取上述溶液到入支架材料，然后用二次蒸餾水浸泡洗滌15 min (3次)，冷凍干燥24 h，得到負(fù)載兩種生長因子的CS/CBB支架材料。

1.4材料的表征

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4500)對材料進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)的觀察。

1.5體外細(xì)胞培養(yǎng)

無機(jī)化學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為入手和學(xué)習(xí)的一門課程，在理論課后要用實(shí)驗(yàn)去鞏固所學(xué)習(xí)的知識，在做實(shí)驗(yàn)的過程中，需要向?qū)W生灌輸認(rèn)真細(xì)致的實(shí)驗(yàn)態(tài)度，追求實(shí)事求是的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)可以檢驗(yàn)課本所教授的知識，同時(shí)可以強(qiáng)化理論的學(xué)習(xí)，鞏固理論知識。

1.5.1細(xì)胞增殖

取P3代MC3T3-E1細(xì)胞，以密度為1×106個(gè)/mL接種在T25培養(yǎng)瓶中，用a-MEM培養(yǎng)。細(xì)胞共分為CON組(不含生長因子)、BMP-2組(1 μg/mL, 1.25 μg/mL)、APN組(100 μg/mL, 200 μg/mL)。將上述各組細(xì)胞接種細(xì)胞懸液于96孔板中(1×103個(gè)/孔)。隔天換培養(yǎng)基。分別于第1、3、5、7、14 d每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀(Bro-rad 680)測定450 nm吸光度值。

1.5.2實(shí)時(shí)定量PCR 測定

取P3代MC3T3-E1細(xì)胞，以密度為1×106個(gè)/mL接種在T25培養(yǎng)瓶中，用a-MEM培養(yǎng)。接種第2 d換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(在上述a-MEM基礎(chǔ)上加入10E-8M DEX、50 μg/mL VC, 10 mM β-磷酸甘油)。

細(xì)胞共分為3組，CON組(不含生長因子)、BMP-2組(1.25 μg/mL)、APN組(100 μg/mL)。分別在第3和第7 d收集細(xì)胞。再通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測ALP、BMP-2、OCN、OPN、AdipoR1 和AdipoR2基因在BMP-2和APN2處理后的mRNA水平表達(dá)的變化。

將MC3T3-E1細(xì)胞于體外使用成骨誘導(dǎo)基培養(yǎng)，第3和第7 d時(shí)，收集細(xì)胞，提取總RNA(#55-11120，SinoGene Scientific)。分光光度計(jì)測定濃度(Biophotometer，Eppendorf), 取1 μg總RNA進(jìn)行DNaseI處理(EN0521, Fermentas)，然后反轉(zhuǎn)錄(Thermo First cDNA Synthesis Kit，#33-20102，SinoGene Scientific)。ALP、BMP-2、OCN、OPN、AdipoR1、AdipoR2及ACTB序列參照GeneBank(引物序列如表1)。qPCR反應(yīng)體系按照10 μL 2×SG PCR MasterMix(#33-10201，SinoGene Scientific), 0.4 μLForward/Reverse primer(5 μM)，1 μLcDNA和8.2 μL ddH2O進(jìn)行配置，在定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)(Applied Biosystems ABI StepOnePLUS)。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95℃、10 min；40個(gè)循環(huán)的95℃、30 s，61℃、31 s；最后按照儀器默認(rèn)添加熔解程序：95℃、15 s，60℃、30 s，和95℃、15 s，以驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。內(nèi)參基因同時(shí)檢測，用2-△△Ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 引物信息Tab.1 The chain of primers

1.5.3Westen-Blot測定

首先90V電泳30 min，后120 V電泳2 h，然后300 mM，2 h轉(zhuǎn)到PVDF膜上。無蛋白快速封閉液(#66-11402，SinoGene)封閉(3～5)min，進(jìn)行室溫下一抗孵育2 h，抗體Anti-ALP(sc-79839),Anti-BMP-2(sc-6267)、Anti-OCN(sc-30045),Anti-OPN(sc-21742)、anti-AdipoR1(sc-46748),Anti-AdipoR2(sc-46756)，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000。TBST漂洗3次后，加二抗(1∶2 000)孵育1 h后，ECL發(fā)光(29050，Engreen)，暗室曝光檢測。Stripping Buffer(#66-11501，SinoGene Scientific)洗脫后，重新標(biāo)記內(nèi)參Actin(一抗，M20009，Ab-mart)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

采用Graph Pad Prism 4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次獨(dú)立操作。采用ANOVA 檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用雙尾t檢驗(yàn)，3組或3組以上比較采用Turkey-Kramer 檢驗(yàn)。P<0．05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1材料形貌觀察

負(fù)載不同生長因子的微球形狀及表面形態(tài)如圖1 所示。圖1中(a)和(b)分別表示CS微球負(fù)載脂聯(lián)素和BMP-2后的微觀形態(tài)圖。微球均呈現(xiàn)出很好的球形，這是由于乳化離子交聯(lián)法有利于CS和Vanillin之間發(fā)生了很好地交聯(lián)作用。相對于負(fù)載脂聯(lián)素的殼聚糖微球，負(fù)載BMP-2的緩釋微球表面更為光滑。所制備的殼聚糖微球的球形良好，整個(gè)球體表面光滑無皺。應(yīng)用掃描電鏡測量所制備微球的直徑，所制備的微球平均直徑為9.634 μm。在CS/BMP-2微球的制備過程中，BMP-2離子濃度影響了與CS之間的交聯(lián)作用。

圖1 負(fù)載不同生長因子微球的SEM圖片。(a)脂聯(lián)素；(b)BMP-2Fig.1 SEM of different CMs. (a) APN; (b) BMP-2

2.2細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

為了評價(jià)該緩釋系統(tǒng)的生物活性，實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法測量不同組成骨細(xì)胞的增殖活性(見圖2)?？傮w來說，隨著共培養(yǎng)的時(shí)間由1 d增加到14 d，兩種生長因子實(shí)驗(yàn)組和對照組中的成骨細(xì)胞總量都有不同程度的增加，可見各組成骨細(xì)胞均處于增殖狀態(tài)。而且，隨著BMP-2濃度的增加，細(xì)胞增殖速度比脂聯(lián)素組顯著性加快。這說明負(fù)載BMP-2生長因子的緩釋體系更有利于小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖。

2.3實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

從表1中qPCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析可以看出，ALP、BMP-2、OCN、OPN、AdipoR2基因在第3和第7 d，在BMP-2和APN處理時(shí)，RNA樣品提取及濃度均出現(xiàn)上調(diào)趨勢。AdipoR1基因沒有表現(xiàn)出這個(gè)趨勢。

圖2 不同的緩釋體系對MC3T3細(xì)胞增殖影響Fig.2 The proliferation of MC3T3- co-cultured with materials

再從圖3中可以發(fā)現(xiàn)ALP、BMP-2、OCN和 AdipoR2基因在APN處理組增加倍數(shù)高于BMP-2處理組。與對照組相比，ALP基因在第3和第7 d時(shí)，BMP-2組分別增加了1.2和1.8倍，APN組分別增加了5.7和22.5倍。 BMP-2基因在第3和第7 d時(shí)，BMP-2組分別增加了3.2和11.8倍，APN組分別增加了10.1和77.6倍。OCN基因在第3和第7 d時(shí)，BMP-2組分別增加了1.8和8.4倍，APN組分別增加了11.3和76.1倍。AdipoR2基因在第3和第7 d時(shí)，BMP-2組分別增加了1.2和1.8倍，APN組分別增加了4.0和9.3倍。

表1 細(xì)胞中BMP-2和APN基因表達(dá)的不同變化Tab.1 Fold-change of different gene expression in BMP-2 and APN Treatments

注：*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

Note:*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測不同緩釋體系對MC3T3細(xì)胞多個(gè)基因的表達(dá)(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。(a) OPN; (b) OCN; (c) BMP2; (d) ALP;(e) Adipor1;(f) Adipor2Fig.3 Real-Time PCR on MC3T3 cells(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001). (a) OPN; (b) OCN; (c) BMP2; (d) ALP; (e) Adipor1; (f) Adipor2

2.4Western-Blot結(jié)果

如圖4(a)所示，在BMP-2處理后第3 d，OCN、OPN、BMP2、ALP、AdipoR2的蛋白表達(dá)量都明顯出上調(diào)趨勢。如圖4(b)所示，APN處理后第3和第7 d，OCN、OPN、BMP2、ALP、AdipoR1和AdipoR2的蛋白表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢。相對于BMP-2處理僅在第3 d表現(xiàn)出的趨勢，APN處理在第3和第7 d都能促進(jìn)蛋白的表達(dá)。這說明負(fù)載APN的緩釋體系更有利于小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖分化。

圖4 Westen-Blot檢測不同緩釋體系對MC3T3細(xì)胞多個(gè)基因的表達(dá)。(a)BMP-2；(b)APNFig.4 Westen-Blot of MC3T3 cells(a)BMP-2；(b)APN

3 討論

牙槽嵴位點(diǎn)保留(ridge preservation)是在拔牙的當(dāng)時(shí)對牙槽骨吸收過程進(jìn)行干預(yù)，將骨替代材料(graft material)或支架(scaffold)放入拔牙窩，維持拔除牙齒遺留的空隙，達(dá)到牙槽嵴保留目的[16]。牙槽嵴位點(diǎn)保留的治療理念，為保存牙槽骨提供了一種簡單有效的方法，避免了復(fù)雜的植骨手術(shù)，減少了病人的痛苦和費(fèi)用。最近有研究表明，新鮮的拔牙窩放入Bio-Gide膠原膜之后，僅起到支架的作用，不能促進(jìn)新骨形成[17,18]；將骨替代品植入拔牙窩，卻不易被新生骨組織替代，不利于后續(xù)的種植治療[19-20]。為解決這些問題，研究者們開始關(guān)注生物活性因子(bioactive molecules)在拔牙窩骨壁保留中的重要作用，目前國內(nèi)外學(xué)者主要集中于促進(jìn)成骨作用的生物活性因子的研究，例如重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)[13]、辛伐他汀(simvastatin)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)[21]、血小板源生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)[22]、細(xì)胞結(jié)合肽-15(cell-binding peptide-15)[23]等。經(jīng)大量文獻(xiàn)檢索后，尚未發(fā)現(xiàn)有既能促進(jìn)成骨，又能抑制破骨細(xì)胞作用的生物活性因子用于牙槽嵴骨壁保留的文獻(xiàn)報(bào)道。

BMP-2是一種可溶的、低分子跨膜糖蛋白，研究表明BMP-2可以誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，上調(diào)堿性磷酸酶活性，上調(diào)骨鈣素和I型膠原的表達(dá)，增加礦化基質(zhì)，在局部其對膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨均有誘導(dǎo)作用。然而，骨組織改建包括兩個(gè)方面：成骨細(xì)胞(osteoblasts)參與的骨形成過程和破骨細(xì)胞(osteoclasts)介導(dǎo)的骨吸收過程，二者共同構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)的動(dòng)態(tài)平衡的過程[24-25]。骨形成與骨吸收的平衡，受機(jī)體局部和全身因素的影響，通過改變成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的細(xì)胞分化和細(xì)胞活性得以實(shí)現(xiàn)[29]。因此，可以在拔牙窩局部使用生物活性因子，促進(jìn)局部成骨細(xì)胞的成骨能力或抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，達(dá)到牙槽嵴骨壁保留的目的。

脂聯(lián)素是20世紀(jì)90年代中期由美國、日本4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)小組從不同角度相繼在動(dòng)物及人類脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，由247 個(gè)氨基酸組成，存在2種受體，AdipoR1和AdipoR2。體外實(shí)驗(yàn)證明，脂聯(lián)素通過抑制TLR4介導(dǎo)的NF-kappa B激活，進(jìn)而抑制小鼠單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟；另一方面，脂聯(lián)素通過激活A(yù)dipoRl/JNK、AdipoRl/P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞的增殖及分化，促進(jìn)成骨[14-15]。因此APN既能抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，同時(shí)又能增加成骨細(xì)胞的活性和骨基質(zhì)的礦化。

煅燒骨作為支架材料在成骨過程中主要起骨引導(dǎo)作用，既形成一個(gè)物理支架吸附種子細(xì)胞順此支架爬行、增殖并形成新骨。而骨生長因子在骨修復(fù)過程中能誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞加速增殖。由于骨改建包括成骨細(xì)胞參與的骨形成過程和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程，二者共同構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)的動(dòng)態(tài)平衡的過程。研究采用促進(jìn)成骨作用的BMP-2與既能抑制破骨、又能促進(jìn)成骨的APN作為骨替代材料緩釋的生物因子，發(fā)現(xiàn)在蛋白表達(dá)水平，BMP-2處理后第3d表現(xiàn)明顯出現(xiàn)上調(diào)趨勢。APN處理后第3和第7d也出現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢。此外，ALP、BMP-2、OCN、OPN、Adipor1和Adipor2基因表達(dá)水平，BMP-2和APN組均出現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢。但負(fù)載生長因子APN組較BMP-2組上調(diào)趨勢更加明顯。

4 結(jié)論

本研究表明，外源性的BMP-2和APN作為骨替代材料緩釋的生物因子，在干細(xì)胞向成骨分化過程中起促進(jìn)作用。APN一定濃度下，既能抑制破骨、又能促進(jìn)成骨向分化。所以載APN植骨材料較BMP-2植骨材料更加促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。

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Effect of Proliferation and Differentiation MC3T3-E1 by Two Different Growth Factors in the Bone Substitution

Li Deli1?Li Qing2,3?Wang Tong1Wu Yuwei1Lu Songhe1Hu Hongcheng1Tang Zhihui3*

1(The 2nd Dental Center, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100012, China)2(Center of Digital Dentistry, Peking University School and Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China)3(National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology, Beijing 100081, China)

More and more scientists focus on the growth factors that can improve the bone regeneration. The aim of the study was to prepare a bone scaffolds, and to investigate underlying molecular mechanisms in promoting osteogenesis on the socket of tooth extraction. Chitosan microspheres carrying two osteogenic factors, BMP-2 or APN, were prepared by emulsion crosslinking, and then were mixed with ceramic bovine bone to form a novel drug delivery system. To compare the biological activity of the grafts, MC3T3-E1 cells were seeded in the scaffold. The influence of the scaffold on cells proliferation and differentiation were investigated. Results show that the average diameter of the chitosan microspheres is 9.634 μm. The scaffolds loading BMP-2 or APN both contributed to the proliferation of osteoblasts MC3T3-E1. Cells seeded in the scaffold loading BMP-2 showed higher proliferation. However, cells seeded in the adiponectin-loading scaffold showed a higher level in the expression of osteogenesis-related proteins and genes compared with those in the BMP-2 loading scaffold.

bone morphogenetic protein-2(BMP-2); adiponectin (APN); MC3T3-E1; drug delivery

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 03.009

2014-10-10， 錄用日期:2015-04-10

首都市民健康項(xiàng)目培育項(xiàng)目(z2110005312001)

R318

A

0258-8021(2015) 03-0323-07

?共同第一作者

*通信作者(Corresponding author)， E-mail: tang_zhihui@live.cn