何榮芬

(安徽省淮北市人民醫(yī)院，安徽 淮北 235000)

膽汁檳榔維B1膠囊由豬膽汁提取物、檳榔粉、維生素B1、香蘭素組成，臨床用于各種便秘，以及由于腹腔炎癥、腸粘連、肝膽疾病等致胃腸功能紊亂而引起的腹痛、食欲不振等。其藥品標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)(第九冊)》[WS－10001－(HD－0861)－2002]，其中有對豬膽汁提取物有效成分的薄層鑒別，但無對其有效成分豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量測定。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜法－蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC－ELSD)法檢測膽汁檳榔維B1膠囊中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Thermo U－3000型液相色譜系統(tǒng);ChromeleonTM7色譜工作站;ELSD 2000ES型檢測器;JAC－300型超聲波處理器(濟(jì)寧奧波超聲電氣有限公司);Mettler AE－240型電子分析天平(0.1mg;0.01 mg);HC－3018型臺式高速離心機(jī);SHY－2A型恒溫水浴振蕩器。鵝去氧膽酸對照品(批號110806－200704;供含量測定用);豬去氧膽酸對照品(批號100087－200610，供含量測定用，供HPLC法測定時含量為97.3%)，均購自中國藥品生物制品檢定所;膽汁檳榔維B1膠囊(鄭州市瑞龍制藥股份有限公司，批號分別為 130201，130501，130504，130605);乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1－3]

色譜柱:Thermo C18柱(250mm ×4.6mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1%冰醋酸(53 ∶47);流速:1.0mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10μL;檢測器條件:漂移管溫度105℃，檢測器增益為1，撞擊管關(guān)閉，氣體流速2.0 L/min。

2.2 溶液制備

稱取豬去氧膽酸對照品55.32mg，鵝去氧膽酸對照品27.87mg，精密稱定，同置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1mL中含豬去氧膽酸2 153.0μg、鵝去氧膽酸1 114.8μg的混合溶液，作為對照品貯備液[4]。取本品研細(xì)，混勻，取細(xì)粉約0.08 g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉10mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置滅菌鍋中，于120℃、壓力103 kPa加熱4 h，放冷，離心，上清液移至100mL容量瓶中，藥渣加水3mL，震蕩洗滌，離心，取上清液再重復(fù)洗滌2次，洗液并入容量瓶中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6～7，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按處方稱取除豬膽汁膏外的藥材粉末0.08 g，按供試品制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗:取2.2項下3種溶液，依法進(jìn)樣。在供試品溶液色譜中，與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照品溶液色譜則無此峰出現(xiàn)，表明其他成分不干擾測定，見圖1。

線性關(guān)系考察:精密量取對照品貯備液 0.5，1.0，2.0，5.0，6.0，置50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，按上述色譜條件，精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)[5]、質(zhì)量濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為豬去氧膽酸為 Y=1.274 6X－1.946 8(r=0.999 7)，鵝去氧膽酸為 Y=1.162 8X －1.641 5(r=0.999 5)。結(jié)果表明，豬去氧膽酸質(zhì)量濃度在 21.53～258.36μg/mL、鵝去氧膽酸在11.148～133.776μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:精密量取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸峰面積的 RSD分別為0.54%和1.60%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品(批號130201)溶液，每隔2 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸峰面積的自然對數(shù)RSD為0.77%和1.21%(n=9)，表明供試品溶液在16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗:取同一批號(批號130201)樣品6份，各測定2次，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果豬去氧膽酸平均含量為124.193 5 mg/g，RSD 為 1.90%;鵝去氧膽酸的平均含量為97.698 8mg/g，RSD為2.20%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗[6]:稱取已知含量的樣品(批號130201)，共9份，分成3組，分別精密加入混合對照品溶液(每1mL中含豬去氧膽酸 778.4 μg、含鵝去氧膽酸 756.0 μg)4，5，6mL，置 100mL容量瓶中，按供試品溶液制備方法配制溶液，按擬訂條件測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，各2份，稱取細(xì)粉約0.08 g，依法制備供試品溶液，精密量取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，用回歸方程計算含量。結(jié)果批號為130501，130504，130605的樣品中含豬去氧膽酸 125.074 8，124.852 8，126.400 8mg/g，鵝去氧膽酸 97.147 6，99.539 7，101.173 6mg/g。

3 討論

目前，中國藥典收載品種標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[7]報道，多以薄層掃描法測定豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類物質(zhì)，僅有紫外末端吸收，不適合用紫外檢測器測定，因此選用ELSD檢測。本研究中采用專屬性更強(qiáng)、靈敏度更高、操作簡單的HPLC－ELSD法對膽汁檳榔維B1膠囊中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸進(jìn)行了測定，并對含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)考察，結(jié)果表明，該方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效控制該制劑的質(zhì)量。本試驗比較30℃，40℃的柱溫發(fā)現(xiàn)，升高柱溫后分離效果、峰形及面積并沒有改善，采用20℃的柱溫達(dá)到了滿意效果。通過試驗比較105℃和95℃漂移管溫度，結(jié)果105℃時峰面積達(dá)最大。在色譜條件選擇的過程中，經(jīng)試驗，乙腈－0.1%冰醋酸(53∶47)為流動相、流速1.0mL/min時分離度大于1.5，樣品中其他成分對二者測定無干擾。

[1]唐元軍，陳育琳，陳慶輝.HPLC－ELSD法同時測定豬膽粉中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21(6):651－653.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1 236.

[3]李志萬，馬 強(qiáng)，袁永生，等.HPLC－ELSD法對豬膽粉中豬去氧膽酸的含量測定研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2005，11(5):14.

[5]麥意梅，于永洲.霍膽丸中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2010，21(10):2 702 －2 703.

[6]盛 燕，陸靜嫻，趙衛(wèi)民，等.膽酸止咳片中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定 [J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(12):1 645－1 647.

[7]祝 明，陳必蓮.薄層掃描法測定豬膽汁提取物中豬去氧膽酸含量[J].中國藥業(yè)，2000，9(6):14 －15.