徐榮　張敏（宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科　宜春　336000）

MRSA醫(yī)院感染危險(xiǎn)因素及分子流行病學(xué)調(diào)查

徐榮*張敏
（宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科宜春336000）

目的：研究醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（HA-MRSA）感染的危險(xiǎn)因素和耐藥表型，并利用隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性PCR（RAPD-PCR）對(duì)菌株同源性進(jìn)行分析。方法：以無(wú)感染者為對(duì)照，比較50例HA-MRSA感染者的年齡、基礎(chǔ)疾病、住院時(shí)間、抗菌藥物使用、免疫抑制劑使用和侵入性手術(shù)操作等感染相關(guān)因素。采用K-B法檢測(cè)HA-MRSA的耐藥表型。利用RAPD-PCR對(duì)50株HA-MRSA的基因同源性進(jìn)行分析。結(jié)果：2種或7 d以上抗菌藥物使用和住院時(shí)間延長(zhǎng)（>12 d）是HA-MRSA的危險(xiǎn)因素。HA-MRSA依據(jù)RAPD可分為Ⅰ～Ⅵ型，以Ⅰ型（40%）和Ⅲ型（26%）為主。RAPD分型相同菌株具有同樣的耐藥表型，Ⅴ型耐藥最為嚴(yán)重。結(jié)論：為有效預(yù)防HA-MRSA感染，臨床要注重合理選用抗菌藥物，降低使用強(qiáng)度，并縮短病人住院時(shí)間。RAPD-PCR分型可為HA-MRSA的流行病學(xué)監(jiān)控提供線索。

醫(yī)院感染MRSA危險(xiǎn)因素隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性

金黃色葡萄球菌抵抗力和致病力都很強(qiáng)，是醫(yī)院感染最常見、最重要的病原菌之一。隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，環(huán)境選擇壓力下耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染率呈逐漸上升趨勢(shì)，導(dǎo)致了患者病死率升高、住院期延長(zhǎng)和醫(yī)療費(fèi)用增加等問題[1]。因此，必須采取措施控制醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（HA-MRSA）的傳播，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。本研究旨在探討HA-MRSA的易感因素，采用隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性PCR（RAPD-PCR）對(duì)我院分離的HAMRSA菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分型，并調(diào)查其耐藥表型。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例和菌株

收集我院2013年3月至2014年6月間出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染病例和菌株，以50例HA-MRSA感染患者作為研究組，50例與研究組患者同科室、同期入院、無(wú)感染患者作為對(duì)照組。HA-MRSA感染患者篩選標(biāo)準(zhǔn)為入院時(shí)無(wú)感染或細(xì)菌培養(yǎng)未分離出金黃色葡萄球菌，2 d后才出現(xiàn)MRSA感染。

1.1.2儀器和試劑

DNA Engine PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司，凝膠電泳儀和成像系統(tǒng)購(gòu)自Tanon公司。K-B法藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物有限公司，RAPD-PCR引物（5’-GAGAGGCCTCGCAGGCATGACCT-3’）、rTaq酶和DL2000 DNA Marker購(gòu)自Takara公司。

1.2方法

1.2.1易感因素分析

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分析，調(diào)查研究組和對(duì)照組患者以下7種感染相關(guān)因素：①老齡（＞65歲）；②住院時(shí)間延長(zhǎng)（＞12 d）；③基礎(chǔ)疾??；④2種以上抗菌藥物使用；⑤7 d以上抗菌藥物使用；⑥免疫抑制劑使用；⑦2項(xiàng)以上侵入性手術(shù)操作。統(tǒng)計(jì)兩組之間計(jì)數(shù)資料有無(wú)顯著性差異，并計(jì)算比數(shù)比（odds ratio, OR）。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 13.0，方法采用多因素二分類Logistic回歸，選入方程內(nèi)變量的方法為“Enter”。

1.2.2耐藥表型檢測(cè)

參照CLSI 2012年標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B法對(duì)從50例患者中分離到的50株HA-MRSA菌株的耐藥表型進(jìn)行檢測(cè)，抗菌藥物包括慶大霉素（GEN）、環(huán)丙沙星（CIP）、復(fù)方新諾明（SXT）、紅霉素（ERY）和克林霉素（CLI）。

1.2.3RAPD分型

通過煮沸法[2]制備DNA模板，參照文獻(xiàn)合成RAPDPCR引物[3]。反應(yīng)體系（25 ml）：MgCl22.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物1.2 mmol/L，rTaq酶2.5 U，DNA模板約125 ng。反應(yīng)過程：94℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，36℃1 min，72℃2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2　結(jié)果

2.1易感因素分析

對(duì)研究組和對(duì)照組各50例患者的感染相關(guān)因素符合率進(jìn)行二分類Logistic回歸分析（表1）。與對(duì)照組患者相比，HA-MRSA感染者的3個(gè)易感因素（P<0.05）依OR排序依次為：7 d以上抗菌藥物使用（15）、2種以上抗菌藥物使用（9.8）和住院時(shí)間延長(zhǎng)（7.5）。

表1　兩組感染相關(guān)因素符合率與Logistic回歸分析（例）

2.2耐藥表型檢測(cè)

對(duì)50株HA-MRSA進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)(表 2)，可分為A～D型，以A型和B型為主。A型耐藥譜最窄，C型耐藥譜最廣。HA-MRSA對(duì)抗生素的耐藥率從低到高依次為SXT（14%）、CIP（50%）、GEN（54%）、CLI（100%）和ERY（100%）。

2.3 RAPD分型

對(duì)50株HA-MRSA進(jìn)行RAPD分型，48株菌（96%）得出清晰、穩(wěn)定的譜帶，譜帶如有2條或2條以上條帶不同就認(rèn)為是不同菌株[4]。48株菌可分為Ⅰ～Ⅵ型（圖1），以Ⅰ型（40%）和Ⅲ型（26%）為主。RAPD分型相同菌株具有相同的耐藥表型，Ⅰ型和Ⅱ型的耐藥表型為A型，Ⅲ型和Ⅳ型的耐藥表型為B型，Ⅴ型和Ⅵ型的耐藥表型則分別為C型和D型（表 3）。

表2　50株HA-MRSA的耐藥表型

圖1　HA-MRSA菌株RAPD分型

表3　RAPD分型與耐藥表型的關(guān)系

3　討論

HA-MRSA的感染可能的相關(guān)因素過去被認(rèn)為可能包括年齡、基礎(chǔ)疾病、住院時(shí)間延長(zhǎng)、不規(guī)范使用抗菌藥物、免疫抑制劑的使用和侵入性手術(shù)操作等[5]。對(duì)本院患者的調(diào)查分析顯示，HA-MRSA的易感因素有住院時(shí)間延長(zhǎng)（＞12 d）、7 d以上抗菌藥物使用和2種以上抗菌藥物使用，其中7 d以上抗菌藥物使用（OR＝15）是最危險(xiǎn)因素。數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明臨床診療中必須依據(jù)藥敏試驗(yàn)謹(jǐn)慎使用抗菌藥物，并盡量縮短患者抗菌藥物使用時(shí)間和住院時(shí)間。

耐藥表型檢測(cè)結(jié)果顯示，本院HA-MRSA菌株耐藥表型以A型（46%）和B型（36%）為主，有14%的菌株（C型）對(duì)分型用5種藥物都耐藥。可能由于本院藥品采購(gòu)目錄無(wú)SXT，HA-MRSA對(duì)SXT的耐藥率較低（＜30%），但使用當(dāng)中葡萄球菌對(duì)其易產(chǎn)生耐藥性，建議臨床在經(jīng)驗(yàn)治療HA-MRSA時(shí)仍應(yīng)首選萬(wàn)古霉素。

葡萄球菌菌株分型方法主要有表型分型和基因分型二類，常用基因分型方法包括脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型、RAPD分型、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性、多位點(diǎn)測(cè)序分型和spa基因分型等，其中RAPD分型因操作簡(jiǎn)便和成本低廉而被廣泛應(yīng)用于局域流行菌株的監(jiān)測(cè)[3,6-10]。本院50株HA-MRSA采用RAPD分型方法可分為Ⅰ～Ⅵ型，RAPD分型相同菌株具有同樣的耐藥表型，說明在流行病學(xué)調(diào)查方面，其分辨率要高于耐藥表型分型，可為HA-MRSA的流行病學(xué)監(jiān)控提供線索。

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Susceptible factors and molecular epidemiological investigation of MRSA nosocomial infection

XU Rong*, ZHANG Min
(Clinical Laboratory, The People’s Hospital of Yichun City, Yichun 336000, China)

Objective: To study the susceptible factors, drug-resistant phenotype and gene homology of hospitalacquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (HA-MRSA). Methods: Infection-related factors in 50 patients infected with HA-MRSA were investigated and analyzed, and the results were compared with those of the patients without infection. Drugresistant phenotypes of HA-MRSA were determined by K-B method. Gene homology of HA-MRSA was analyzed using RAPDPCR. Results: Use of antibacterial drugs more than 2 kinds or for over 7 days and prolonged hospitalization were the susceptible factors of HA-MRSA. HA-MRSA could be divided into typeⅠ～Ⅵ based on RAPD-PCR. TypeⅠand Ⅲaccounted for 40% and 26%. The isolated strains with same gene homology showed the same drug-resistant phenotype, in which the strains with typeⅤwere the most seriously resistant to the tested antibacterials. Conclusion: Great attention should be paid to the reasonable use of antimicrobial agents, reducing the intensity of their medication, and shortening the time for hospital stay in order to effectively prevent HA-MRSA infection. RAPD-PCR can provide effective technical support for epidemiological surveillance of HA-MRSA.

hospital infection; MRSA; susceptible factor; RAPD

R515.9; R378.11

B

1006-1533(2015)15-0033-03

徐榮（1985-），男，主管技師，從事臨床微生物學(xué)研究。E-mail: rong.xunc@aliyun.com

2015-03-23）