劉文 賈義華 方麗 劉長(zhǎng)愛(ài) 陳浩 路凱敏 胡巍

氧和鐵是生物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生O2-、H2O2、·OH等自由基（Reactive oxygen species，ROS），造成氧化壓力［1］，對(duì) DNA、蛋白質(zhì)、膜脂等細(xì)胞組分造成氧化損傷［2，3］。Almiron和Azam等［4，5］在長(zhǎng)期饑餓培養(yǎng)的大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）中發(fā)現(xiàn)一種消除ROS的抗氧化蛋白，命名為DPS（DNA-binding proteins from starved cells）。現(xiàn)已證實(shí)DPS蛋白廣泛分布于細(xì)菌體內(nèi)，是一種重要的抗脅迫蛋白［6］。細(xì)菌處于生長(zhǎng)靜止期或受脅迫時(shí)在體內(nèi)表達(dá)DPS蛋白，并與DNA結(jié)合，形成緊密的DPS-DNA復(fù)合體，保護(hù)DNA免受氧化損傷［7］。同時(shí)，作為鐵蛋白超家族一員，DPS以十二聚體結(jié)構(gòu)結(jié)合并儲(chǔ)存鐵，調(diào)節(jié)鐵的供應(yīng)，防止鐵鹽沉淀造成的毒性損傷［8，9］。十二聚體結(jié)構(gòu)作為DPS發(fā)揮功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其自組裝過(guò)程研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究以大腸桿菌基因組為模板，用基因工程原核表達(dá)DPS，應(yīng)用純化的DPS觀察其在體外條件下的自組裝情況，旨在為研究其自組裝和抗氧化活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、載體、培養(yǎng)基和試劑 菌株為大腸桿菌0111菌株和DH5α菌株（本實(shí)驗(yàn)室保存）。原核表達(dá)載體是pBV220質(zhì)粒。LB細(xì)菌培養(yǎng)基由Oxiod公司胰蛋白胨和酵母提取物配制而成。鼠源抗HIS單抗（Anti-His mA）為Earthox產(chǎn)品，羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。親和層析用1mL His Trap FF crude column柱為GE公司產(chǎn)品。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 工具酶和試劑盒 核酸限制內(nèi)切酶EcoR I、BamH I，Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等均為Fermentas公司產(chǎn)品。多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自北京博大泰克公司。透析袋（Ф27 mm）為Union Carbide Corporation產(chǎn)品。DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)、基因擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建 模板為提取的0111菌株基因組DNA。特異性上下游引物為5'-CGGAATTCATGAGTACCGC-3'和5'-GCGGATCCTTAGTGATGATGATGATGATGTTCGATGTTAGACTCG-3'，是參考GenBank中大腸桿菌dps基因序列設(shè)計(jì)，其中上游引物引入EcoR I酶切位點(diǎn)序列和ATG，下游引物引入6×His序列（斜體部分）、TAA以及BamH I酶切位點(diǎn)序列。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

目的基因和提取的pBV220質(zhì)粒分別用EcoR I、BamH I雙酶切，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定?；驕y(cè)序送北京華大基因公司完成測(cè)序。

1.2.2 蛋白表達(dá)和純化 工程菌在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，42℃過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。沉淀細(xì)胞超聲破碎后分別取上清和沉淀，用SDS-PAGE（4％濃縮膠，12％分離膠）和Westernblotting檢測(cè)鑒定目的蛋白。

用His Trap FF crude column親和層析柱純化目的蛋白。超聲破碎菌體并提取包涵體，用含6mol/L脲的20mmol/L磷酸鹽緩沖液（PB）溶解包涵體后加入到層析柱中，再用含100-400mmol/L咪唑的特異性洗脫緩沖液洗脫，SDS-PAGE分析洗脫組分。

1.2.3 DPS自組裝鑒定 將純化的DPS蛋白分別用含4、2和0.5mmol/L脲的PB緩沖液，分級(jí)逐步透析去除蛋白溶液中的6mmol/L脲，進(jìn)行非變性PAGE電泳分析，濃縮膠為4％，分離膠為10％。

1.2.4 DPS對(duì)DNA的抗氧化保護(hù) 將等體積DPS（1.8mg/mL）和等體積pBV220質(zhì)粒（40 ng/mL）混合后，加入等量的Fenton試劑（終濃度為10mmol/L H2O2，100mmol/L FeSO4，50mmol/L Tris-HCl），37℃孵育24h，1.2％瓊脂糖電泳，檢測(cè)質(zhì)粒DNA降解情況。同時(shí)分別用質(zhì)粒、加熱變性的DPS、BSA蛋白與Fenton試劑孵育作為對(duì)照體系。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增與表達(dá)載體構(gòu)建

圖1 pBVDPSHis載體及鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了一條特異性DNA片段，長(zhǎng)度與dps基因522bp相當(dāng)，重組載體雙酶切鑒定也得到了該片段（圖1）。經(jīng)DNA測(cè)序鑒定，重組載體插入了3'-末端帶有6×His標(biāo)簽的dps基因序列（測(cè)序結(jié)果略）。

2.2 DPS蛋白表達(dá)及純化鑒定

從SDS-PAGE結(jié)果（圖2-A）可以看出，42℃誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞中存在分子量接近20kD的表達(dá)蛋白條帶，該蛋白與DPS單體蛋白的理論分子量19.5kD相當(dāng)。用Anti-His mA單抗進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果（圖2-B）表明，工程菌成功表達(dá)了帶有HIS標(biāo)簽的DPS蛋白。另外，表達(dá)蛋白主要存在沉淀中，說(shuō)明該蛋白是以包涵體形式獲得高效表達(dá)。

圖2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE（A）和Western blotting分析（B）

蛋白純化后的SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，在特異性洗脫組分中含有目的蛋白（圖3泳道6-9），其中300和400mmol/L咪唑洗脫組分中得到較純的DPS蛋白。

圖3 DPS蛋白SDS-PAGE結(jié)果

2.3 DPS體外自組裝

純化的DPS蛋白進(jìn)行PAGE分析結(jié)果（圖4）顯示，DPS蛋白在6mmol/L脲的PB中出現(xiàn)多條條帶，說(shuō)明變性蛋白雖能組裝成大分子量（十二）聚體，但仍然有大量的低聚體存在，分子量大多都超過(guò)66.7kD。相比而言，脲降低到0.5mmol/L時(shí)蛋白低聚體比例大大降低，大分子量（十二）聚體蛋白更加穩(wěn)定。如果在0.5mmol/L脲的蛋白中添加NaCl，可以明顯促進(jìn)大分子聚合體的形成，特別是50mmol/L NaCl濃度時(shí)，幾乎所有蛋白都自組裝成穩(wěn)定的十二聚體蛋白，說(shuō)明NaCl能促進(jìn)自組裝過(guò)程。

圖4 純化的DPS蛋白PAGE結(jié)果

2.4 DPS對(duì)DNA的抗氧化保護(hù)

結(jié)果（圖5）顯示，F(xiàn)enton反應(yīng)后，質(zhì)粒DNA在不含DPS的反應(yīng)體系中被完全降解，在含DPS的反應(yīng)體系中保持不變，在含熱變性DPS的體系中被部分降解，而在含BSA蛋白的對(duì)照組同樣被降解。上述結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)enton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基對(duì)DNA分子造成氧化破壞，而DPS對(duì)DNA分子有抗氧化保護(hù)作用，加熱變性后的DPS仍有部分保護(hù)作用，而且DPS對(duì)DNA的抗氧化保護(hù)是其特異性的功能，BSA不具備同樣功能。

3 討論

作為細(xì)菌內(nèi)的抗氧化保護(hù)蛋白，DPS蛋白在菌體內(nèi)翻譯、自組裝成十二聚體結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。兩個(gè)相鄰DPS蛋白單體，側(cè)面反向交叉形成一個(gè)面，六個(gè)面圍城一個(gè)近乎球形的六面體，該球形六面體外徑9nm，內(nèi)徑4.5nm，其中空腔穴帶有負(fù)電荷，是鐵成核及礦化部位［10］。有文獻(xiàn)報(bào)道，DPS聚合體是由6個(gè)二聚體組合而成，也有說(shuō)是4個(gè)三聚體組合而成［11，12］。本實(shí)驗(yàn)中觀察到有不同分子量大小的聚合體，部分支持了這種觀點(diǎn)，但也說(shuō)明還可能存在其它聚體形式。實(shí)驗(yàn)中獲得的純化蛋白經(jīng)除脲復(fù)性和添加NaCl后，可以形成穩(wěn)定的分子量均一的聚合，這與文獻(xiàn)報(bào)道的DPS十二聚體的活性結(jié)構(gòu)相吻合［13］。因此可以確定基因工程表達(dá)的DPS能夠自組裝成十二聚體結(jié)構(gòu)。而DPS在Fenton反應(yīng)中對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明體外表達(dá)純化的DPS能夠發(fā)揮抗氧化保護(hù)蛋白功能。

圖5 質(zhì)粒保護(hù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

DPS一方面通過(guò)將Fe2+轉(zhuǎn)化成羥基氧化鐵（FeOOH）形式防止羥自由基產(chǎn)生［14］，并儲(chǔ)存鐵元素，調(diào)節(jié)鐵的利用和儲(chǔ)存間平衡；另一方面，DPS能夠在逆境環(huán)境下與DNA分子形成非序列依賴(lài)性的DPS-DNA復(fù)合體結(jié)晶，穩(wěn)定DNA分子［15-17］。有些病原菌甚至利用DPS蛋白的活性抵抗藥物作用［18］。因此DPS結(jié)構(gòu)及其抗氧化作用都是抗病原菌藥物設(shè)計(jì)的潛在靶點(diǎn)。另外，DPS顆粒狀結(jié)構(gòu)還是小分子抗原的展示平臺(tái)，可用于納米疫苗的研究。

4 結(jié)論

基因工程原核表達(dá)的帶有His標(biāo)簽的DPS蛋白，純化后能自組裝成穩(wěn)定的十二聚體結(jié)構(gòu)并具有抗氧化保護(hù)質(zhì)粒DNA作用。

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