顏君 郭興啟 曹學成

WRKY轉錄因子家族是植物中最大的轉錄調控因子家族之一，能夠調控植物的生長和發(fā)育進程及生物和非生物脅迫。植物基因組測序的大規(guī)模完成，為在基因組水平全面研究WRKY轉錄因子家族提供了可能。2003年，72個擬南芥AtWRKY從測序基因組數據中鑒定出，并且發(fā)現49個參與了病菌防御過程。之后，實時定量PCR（qRT-PCR）、微陣列芯片（Microarray）、RNA測序（RNA-seq）等技術應用到大規(guī)模分析植物WRKY家族的研究中。尤其是2013年后，全基因組鑒定植物WRKY基因家族的研究報道日益增多。本文綜述了近年來全基因組鑒定植物WRKY基因家族和其功能的研究成果，旨在為研究人員提供一定的參考。

1 WRKY轉錄因子的發(fā)現、功能及起源

1.1 WRKY轉錄因子的發(fā)現

1994年，Ishiguro［1］首次從甘薯中克隆出一個WRKY轉錄因子并命名為SPF1，之后人們相繼克隆出WRKY家族的其他成員并研究了它們的特性和功能，主要集中在擬南芥、煙草、大豆和辣椒中［2］。

WRKY基因家族的成員都含有WRKY結構域，其蛋白質序列N端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和CX4-5CXnHXH/C（X為任意氨基酸），屬于鋅指轉錄因子，通過結合靶基因啟動子區(qū)域的W-box［（T）TGACC（A/T）］核苷酸序列而調控基因表達［3］。根據WRKY的結構和特點，可分為3個組（圖1），其中組Ⅰ含有兩個WRKY結構域，而組Ⅱ和組Ⅲ都只含有一個WRKY結構域［4］。

圖1 擬南芥全長WRKY蛋白的結構圖和家族分類圖［4，5］

1.2 WRKY轉錄因子的功能

WRKY轉錄因子家族是植物中最大的轉錄調控因子家族之一，是很多信號網絡不可缺少的一部分，能調控多種植物進程：疾病防御、非生物脅迫應答、營養(yǎng)不足、衰老、種子和毛狀體發(fā)育、胚胎發(fā)生、多種發(fā)育方面及植物激素控制的生物進程；WRKYs可以以同源二聚體或異源二聚體的形式，充當轉錄的激活子或抑制子［6］。WRKY調控涉及到的信號通路，包括脫落酸（Abscisic acid，ABA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）/乙烯（Ethylene，ET）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK）、14-3-3 蛋白、鈣調蛋白（calmodulin）、組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases）、阻力蛋白（Resistance proteins）等［6，7］。

1.3 WRKY轉錄因子的起源和進化

早在 2004年，Ulker［8］就提出組Ⅰ WRKY 基因或許代表著WRKY基因的祖先狀態(tài)。2005年，Zhang等［9］研究了當時公布的基因組數據（包括擬南芥、水稻、綠藻Chlamydomonas reinhardtii等），提出了一個進化模型——WRKY基因起源于原生生物，在綠藻等植物中經過多次基因復制和歧化事件，導致在開花植物中形成一個大的基因家族，例如在水稻中有 100個成員（圖 2）。2005年，Wu等［10］研究了水稻和擬南芥中WRKY基因的起源，發(fā)現水稻組Ⅲ 的基因通過復制和劇烈的擴增產生；在原生生物（Giardia lamblia，Dictyostelium discoideum）和綠藻（Chlamydomonas reinhardtii）中存在WRKY-like的類似祖先的基因。

2 擬南芥和水稻全基因組的WRKY轉錄因子研究

WRKY轉錄因子發(fā)現后，其生物學功能的研究主要依賴于經典分子生物學實驗。隨著基因組測序技術的發(fā)展，特別是植物基因組測序的完成，為在基因組水平全面研究WRKY轉錄因子家族提供了可能。2000年模式植物擬南芥基因組測序完成［11］，2002年水稻基因組測序完成［12］，故全基因組水平WRKY轉錄因子家族的研究首先開始于這兩種植物。

2.1 擬南芥全基因組的WRKY研究

2000年，Eulgem［4］通過分析基因組序列，鑒定出61個擬南芥（Arabidopsis thaliana）WRKY基因（AtWRKY1 to AtWRKY61）。2003年，Dong 等［13］又發(fā)現一些新的WRKY基因（共鑒定出72個）；Northern blotting印記法揭示出這72個AtWRKY中有49個有差別地調節(jié)了抗病進程，或被SA處理后的反應進程。2006年，Tosti等［14］用實時反轉錄PCR（Real-time reverse transcriptase PCR）和微陣列基因芯片（Gene chip microarray）的方法發(fā)現，WRKY介導了O3壓力誘導的RLKs（Receptor-like kinases）信號通路，這一點和病原體誘導的轉錄反應信號通路相似。2011年，Wang等［15］分析了擬南芥WRKY基因家族的進化，建立了系統進化樹，發(fā)現其分為五個亞組（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb和Ⅲ）；檢查了進化動力，發(fā)現凈化選擇（purifying selection）和功能歧化（Functional divergence）在本家族進化中存在。

圖2 WRKY基因家族的起源和復制模式圖［9］

2.2 水稻全基因組的WRKY研究

2005年，Xie等［16］預測出 81個水稻（Oryza sativa）OsWRKY基因，進化分析支持假說“WRKY基因經過了一次WRKY結構域的復制形成祖先狀態(tài)，后又經過丟失一個WRKY結構域的過程形成了組Ⅱ和組Ⅲ”；染色體分布分析發(fā)現26％的OsWRKY位于1號染色體；Northern blot研究糊粉細胞的WRKY基因的表達模式，發(fā)現OsWRKY-24、-51、-71、 和 -72被 ABA所 誘 導。2006年，Ryu等［17］用半定量 RT-PCR和 Northern blot分析證明一部分的WRKY涉及到了應答水稻病原體感染的防衛(wèi)相關基因的轉錄激活進程：SA處理后，葉片的OsWRKY-45、-62表達量增高；JA處理后，OsWRKY-10、-82和-85增高；同時兩者處理，OsWRKY-30和-83增高。2008年Ramamoorthy等［18］預測出103個OsWRKY基因，77.7％位于水稻復制區(qū)域，45.6％是零碎復制（Fragmentally duplicated），而35％（包含在45.6％中）是串聯復制（Tandem duplicate）；全面轉錄譜分析，發(fā)現正常生長組有65個OsWRKY基因在轉錄豐度和基因表達模式有差異，而在非生物脅迫（冷、干旱、高鹽）壓力和植物激素處理下54個在轉錄豐度表現出很大的不同。

2009年，Berri等［19］發(fā)現 104個 OsWRKY基因中的24個成員差異性地調節(jié)至少一種檢測的生長壓力，存在9個OsWRKY基因簇（由系統進化相關基因和不相關基因組成）顯著地共表達；用基因微陣列芯片和泊松相關系數分析方法發(fā)現AtWRKYs從屬于兩個主要的共調控網絡（COR-A，COR-B）和兩個小點的網絡（COR-C，COR-D）。2014年，Nuruzzaman等［20］分析了水稻近等基因系在可控制情況下、激素處理、干旱狀況下的全轉錄組概況，發(fā)現存在差異基因活化和組織特異性基因活化。

3 其他植物全基因組WRKY轉錄因子研究進展

隨著植物基因組的大面積測序，其他植物全基因組的WRKY轉錄因子研究也在如火如荼地進行。此類研究策略一般如圖3所示，主要分為生物信息學分析和表達模式研究兩部分。

3.1 鑒定和進化方面的分析

全基因組WRKY轉錄因子研究的基礎是通過BLAST或HMM掃描基因組，鑒定出本植物基因組WRKY基因家族成員的數量和序列等（表1）；然后基于保守序列構建系統進化樹，從而對WRKY家族進行分類等其他生物信息學分析。大部分植物的WRKY基因家族的分類是相似的，可以分為3個組和若干亞組［Ⅰ、Ⅱ（Ⅱa-Ⅱe）、Ⅲ］。

圖3 全基因組鑒定和分析WRKY基因家族的一般研究策略

除了家族分類，其他生物信息學分析也是基于研究植物WRKY的全基因組鑒定信息，但是各文獻的研究側重點各不相同，現總結如下。（1）染色體位置分析：有研究發(fā)現其植物的WRKY在有些染色體位置上富集形成了物種特異性的基因簇，來源于片段復制（Segmental duplication）或者串聯復制（Tandem duplication）［23，27，38-40，45，46］。 巴 豆 與水稻、擬南芥、蓖麻的WRKY基因進化分析比較發(fā)現JcWRKY基因沒有發(fā)生基因復制事件［36］。大部分的二穗短柄草BdWRKY集群基因對（Clustered gene pairs）有著高度相似的WRKY結構域，暗示它們或許具有功能冗余［28］。棉花物理圖譜比對發(fā)現GrWRKY和GaWRKY的染色體位置并不相互對應，暗示其二倍體化時發(fā)生了劇烈的染色體重排［38］。（2）進化動力分析 ：玉米［23］、大豆［46］、棉花［38］進化中存在功能歧化現象。中國白菜［32］和棉花［38］經歷了進化選擇。大豆不同的亞組具有不同的進化速率，組Ⅱe和組Ⅲ檢測到很強的正選擇壓力［46］。（3）啟動子分析：歐洲大葉楊很多涉及壓力和防御應答的順式作用元件分布在PtWRKY基因的上游［5］。（4）單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析：許多棉花（GrWRKY和GaWRKY）SNP位點不均等的分布在外顯子和內含子區(qū)域［38］。（5）構建數據庫：構建了一個包含二穗短柄草BrWRKY和其他植物WRKY等功能的數據庫網站（http：//www.igece.org/WRKY/BrachyWRKY/BrachyWRKYIndex.html）［27］。（6）功能注釋和標簽表達分析：揭示小麥TaWRKY的主要功能是對刺激物的應答和對病菌侵擾的防御，分子機制主要是結合DNA；在空白對照植物和由葉銹病菌（Puccinia triticina）接種過的小麥近等基因系之間表達有差異［26］。通過同源分析發(fā)現有些菊花CmWRKY與擬南芥AtWRKY功能相同，有些不一樣［53］。（7）亞細胞定位預測：這些假定的小白菜BcWRKY 蛋白富集于細胞核區(qū)域，BcWRKY-25和-40的實驗更加證實了這一預測［30］。（8）地質年代分析：通過系統進化分析7個WRKY基因，鑒定出山葵屬（Syagrus）是椰子屬（Cocos）的一個姐妹群，兩者分歧時間發(fā)生在3 500萬年前，建立發(fā)生在3 700萬年前的漸新世（Oligocene）的東部巴西地區(qū)［54］。

表1 植物中WRKY的鑒定

還有一些鑒定方面的研究。（1）亞細胞定位：通過綠色熒光蛋白（GFP）觀察了4個歐洲油菜BnWRKY蛋白的細胞亞定位［29］。GFP觀察了大麥HvWRKY1和2的核定位，功能實驗證明兩者是病菌侵染（BghA6，Blumeria graminis f. sp. hordei Speer isolate A6）誘導基因 HvGER4c 的抑制子［22］。（2）蛋白相互作用：在酵母實驗中觀察到橡膠樹HbWRKY-3、-14、-55蛋白結合HbSRPP（橡膠小粒子蛋白，Small rubber particle protein）啟動子并激活其表達，說明HbWRKY可能涉及到自然橡膠的生物合成的轉錄調控［37］。

3.2 表達模式研究

WRKY轉錄因子家族作為重要的基因家族參與應答環(huán)境信號、調節(jié)植物生長發(fā)育過程等?；谌蚪M鑒定研究植物WRKY家族成員的信息，通過qRT-PCR、微陣列基因芯片、轉錄組測序等高通量手段全面研究本植物WRKY家族成員在不同試劑處理、不同環(huán)境壓力下的基因表達模式，為揭示其具體作用機制提供了一定的線索。

3.2.1 qRT-PCR 主要用qRT-PCR的方法驗證了各植物WRKY家族的差異表達、參與了生物脅迫和非生物脅迫、涉及到了JA等各信號通路。歐洲油菜13個BnWRKY基因會對病原真菌和激素處理（ABA、JA、SA、ET、細胞分裂素的一種或多種）反應應答［29］。黃瓜在正常生長條件下48個CsWRKY在轉錄豐度和基因表達模式上表現出明顯的差別，在非生物脅迫（冷、干旱、高鹽）壓力下23個表達有差異性；壓力誘導的CsWRKY 表達模式和擬南芥同系物的表達模式很相似（除了組ⅢCsWRKYs）［44］。歐洲大葉楊PtWRKY亞組III在各種壓力（冷、旱、高鹽、水楊酸）下表達，PtWRKY76在 0.1mmol/L的SA 或25％ PEG-6000（聚乙二醇，polyethylene glycol）處理下可以被劇烈地誘導出來［45］。番茄在不同的發(fā)育進程和應答各種的生物脅迫和非生物脅迫過程中，SlWRKY基因表現出不同的時空表達，18個選擇好的SlWRKY基因應答干旱高鹽壓力和病菌感染壓力［40］。蓖麻正常發(fā)育情況下，RcWRKY基因無論在轉錄豐度水平還是在基因表達模式水平上都表現出差異性［34］。巴豆在正常發(fā)育情況下根、莖、葉、種子4種組織的表達數據揭示，47個JcWRKY基因至少可應答一種非生物脅迫壓力（干旱、鹽堿、磷酸饑餓、氮饑餓）［36］。中國白菜葉片BrWRKY基因應答生物脅迫和非生物脅迫壓力時的表達模式有差異和相似性［32］。番木瓜TF807.3、72.14在低溫下上調，TF807.3、43.76、12.199、12.62涉及到了干旱壓力，TF9.35、18.51、72.14、12.199涉及到了受傷反應，TF12.199、807.3、21.156、18.51被病原體誘導，TF72.14、43.76被 ABA誘導［48］。二穗短柄草BdWRKY基因的表達快速地被各種壓力和植物激素所調節(jié)［28］。橡膠樹組織特異性表達模式檢測結果顯示74個HbWRKYs至少在一種檢測組織中表達，而其他7個HbWRKY則在所有檢測組織中表達量較低，說明HbWRKYs參加細胞內的各種進程；在嫩枝植株加入JA和ET試劑處理后觀察選擇20個HbWRKY基因（其中13個在乳膠中富含）的表達情況，發(fā)現其中17個HbWRKY至少應答一種試劑，說明HbWRKY被JA和ET信號通路調控［37］。15個菊花的CmWRKY基因應答各種植物激素處理、生物脅迫、非生物脅迫（qRT-PCR）［53］。檢測了大豆被P. pachyrhizi感染后8個GmWRKY基因的表達，發(fā)現與敏感型植株相比，抗性型植株的這些基因表達的更早更強［47］。qRT-PCR檢測61個歐洲大葉楊PtWRKY基因的組織特異性表達，發(fā)現只有46個表達在各種組織中（根、莖、葉等），且不同組織中的表達模式大不相同，18個PtWRKY基因被一種或多種壓力處理時表達且轉錄豐度相對高；過量表達SA誘導的基因PtrWRKY89，加速PR蛋白的表達且改善轉基因楊樹對病菌的抗性，說明PtrWRKY89是楊樹中SA依賴的防御信號通路的調節(jié)子［5］。檢驗小白菜葉片，共有22個BcWRKYs在應答至少一種壓力狀況下（脫落酸、冷、高鹽、熱、高滲）差異性地表達，共表達分析結果顯示壓力誘導的BcWRKYs共調控多個非生物脅迫壓力應答信號通路；BcWRKY-33、-40、-53和-70 作為核心調節(jié)子，在壓力誘導的BcWRKYs 共調控網絡中起主要作用［30］。

有些研究用了不止qRT-PCR一種手段。用微陣列芯片Br135K（針對所有BrWRKY基因設計）和RT-PCR（以根莖葉等特異組織為模板）分析，發(fā)現中國白菜BrWRKY的表達有一定的組織特異性，大白菜亞種Chiifu和Kenshin對冷、干旱、高鹽、病菌侵染的BrWRKY應答表達模式不相同［31］。葡萄的7種組織（幼葉、成熟葉、葉卷須、莖尖、根、幼果、成熟果實）中檢測VvWRKYs表達，發(fā)現大部分至少在兩種組織中表達；36種VvWRKYs在冷壓力下表達水平改變；結合各種數據分析（基因芯片、qRT-PCR、全局轉錄組）鑒定出15種VvWRKYs應答冷壓力，其中3個VvWRKY基因可以被ABA所誘導［50］。棉花的微陣列芯片、表達模式數據和qRT-PCR結果顯示，GhWRKY可能調節(jié)纖維、花藥、組織（根、莖、葉、胚胎）的發(fā)育，且涉及到了壓力應答；表達模式分析結果顯示大部分的組Ⅱ和組ⅢGhWRKY在各種壓力下高度表達；而代表著祖先狀態(tài)的組Ⅰ在壓力下的表達量低，似乎對各種壓力都不敏感［39］。2014年，Wang等［55］用 qRT-PCR和RNA測序方法分析了雙單倍體（di-haploid）楊樹（Populus simonii×P. nigra）的51個WRKY基因（共119個）在應答高鹽壓力的基因表達模式，發(fā)現有13個PthWRKY基因在高鹽處理后在根莖葉組織中表達但它們的表達模式很不相同，根據表達量可分為3組：組Ⅰ（PthWRKY-28、-45、-105）表達量低，組Ⅱ（PthWRKY-56、-88、-116）中等，組Ⅲ（PthW RKY-41、-44、-51、-61、-62、-75、-106）高 ；組Ⅱ和組Ⅲ的“誘導擴增-恢復”的動態(tài)表達模式或許說明它們在調控高鹽應答上作用很重要。

3.2.2 微陣列基因芯片 芯片檢測到大麥一些特殊的表達模式；在單子葉植物（大麥）和雙子葉植物（擬南芥）之間的WRKY基因有保守保留的功能［21］。玉米WRKY基因或許參與了其生長和發(fā)育的調控，涉及到了干旱壓力和病菌感染的應答［23］。胡楊對長時程干旱壓力的反應，發(fā)現在轉錄豐度上改變的基因包括一些轉錄因子家族，如WRKY、AP2/EREPB、bZIP等［56］。 一 大 批 葡 萄VvWRKYs應答各種壓力而激活［50］。6個銹病相關的小麥微陣列芯片數據分析后支持功能注釋結論，即TaWRKY應答抗病反應；兩者分析結果的主要代表是 TaWRKY-10、-15、-17、-56［26］。 用 superSAGE、微分離創(chuàng)傷后的RNA測序、微陣列芯片檢驗到75個大豆GmWRKY基因涉及大豆銹菌（Phakopsora pachyrhizi）感染應答的功能［47］。

3.2.3 轉錄組測序 中國白菜的根、莖、葉等組織的BrWRKY有組織特異性表達和差異性表達模式［32］。大豆正常生長狀況下的127個GmWRKY基因在RNA轉錄豐度和基因表達模式水平上都具有顯著的差異性［46］。棉花WRKY基因參與到了不同棉花亞種特殊纖維的發(fā)育；在二倍體棉花和四倍體棉花的纖維發(fā)育過程中，復雜的WRKY基因表達模式也被觀察到，如G. hirsutum中差異性的等位基因Dt和At的基因表達及可變剪切事件［38］。利用公布的RNA-Seq數據在轉錄組水平分析了小麥TaWRKYs基因對干旱應答的情況，在耐旱品種Sivas 111/33和易旱品種Atay 85植株的根和葉片組織中檢測了TaWRKY16/16-A、TaWRKY-17、-19-C，-24、-59、-61、-82的 相 對表達水平發(fā)現，Sivas 111/33根組織中的以上所有基因的量都上調了，其中小麥應答干旱的基因TaWRKY-16、-24、-59、-61、-82 是 首 次 發(fā) 現［25］。2014年，Huang等［57］RNA測序了成熟前和成熟后中國梨（Pyrus ussuriensis）的轉錄組發(fā)現了3 729個差異表達的基因，含有PuWRKYs。高通量轉錄組分析鑒定出61個歐洲大葉楊PtWRKY基因應答生物脅迫和非生物脅迫壓力［5］。

4 問題與展望

目前WRKY轉錄因子的研究還主要集中在單個基因的克隆、表達和功能方面，它們的具體作用機制還不完全清楚。隨著測序技術的發(fā)展和各植物基因組測序信息的公布，使得大規(guī)模全基因組水平鑒定WRKY基因家族以及研究它們在各種壓力應答下的基因表達模式成為可能。這樣的整體性研究會為單個WRKY基因作用機制研究提供一定的預測。文獻分析結果顯示，目前全基因組鑒定WRKY基因家族，主要局限在WRKY的生物信息學分析和表達模式的初步研究，較少有涉及其信號調控網絡精細機制。完善各種環(huán)境壓力應激條件下WRKY的表達模式研究，利用包括二代測序mRNA-seq和蛋白質組學技術等，研究其基因表達變化，同時結合ChIP-seq技術，研究全基因組水平WRKY的結合靶基因，構建WRKY轉錄因子調控網絡，分析不同應激條件下WRKY通過哪些靶基因和通路起到抵抗應答作用等，將是未來的研究熱點。

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