宮慶娟， 汪紅華， 梁 穎， 盧振和， 陳金生， 黃喬?hào)|， 越 宇

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院疼痛科，廣東廣州 510260)

坐骨神經(jīng)周?chē)o予重組大鼠腫瘤壞死因子α(recombinant rat TNF-α，rrTNF)可引起大鼠后爪機(jī)械性痛閾下降和熱痛反應(yīng)增強(qiáng)［1］，rrTNF在體內(nèi)半衰期只有十幾分鐘，卻可引起大鼠持續(xù)約20 d的病理性疼痛，其具體的機(jī)制仍不清楚。已有研究顯示，TNF-α通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛［2］。大量研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的P2X4受體在神經(jīng)病理性疼痛和嗎啡耐受中發(fā)揮重要作用［3-6］;而且我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓表面應(yīng)用ATP，ATP通過(guò)上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體的表達(dá)，誘導(dǎo)C纖維誘發(fā)電位的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)［7］，脊髓背角 LTP 被認(rèn)為是病理性疼痛的神經(jīng)基礎(chǔ)［8］。因此我們?cè)O(shè)想P2X4受體同樣參與坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起的大鼠病理性疼痛。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用成年雄性SD大鼠(180～200 g)，清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，由省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持在(24±1)℃和50～60%的濕度，所有實(shí)驗(yàn)步驟都盡量減輕動(dòng)物的痛苦并按照有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用原則操作。

行為學(xué)測(cè)試大鼠分為生理鹽水(NS)組、TNPATP和PPADS組。Western blot實(shí)驗(yàn)大鼠分為rrTNF 100 ng/L 組(3 d、7 d、14 d)、溶劑組(0.1%牛血清白蛋白即0.1%BSA)和naive對(duì)照組以及NS組、TNPATP和PPADS組。

2 藥物和試劑

rrTNF(R＆D)以10 mg/L的濃度保存在－80℃，給藥前立即用含有0.1%BSA的生理鹽水稀釋為100 ng/L。TNP-ATP［2’，3’-O-(2，4，6-trinitrophenyl)adenosine 5-triphosphate］和 PPADS(pyridoxal phosphate 6-azophenyl-2’，4’-disulphonic acid)購(gòu)于Sigma。TNP-ATP和PPADS先用雙蒸水溶解成儲(chǔ)存液，在臨用前用生理鹽水分別稀釋成所需要的濃度。

3 方法

3.1 PST模型的制備——坐骨神經(jīng)周?chē)补芘c給藥 參照Wei［1］的方法制備埋置在坐骨神經(jīng)周?chē)闹补堋⒚髂z海綿切成15 mm×5 mm×9 mm的塊狀。其中一端被分成兩半并插入一根4 cm長(zhǎng)的PE-10管，并用線(xiàn)將 PE-10管與明膠海綿固定在一起。70%乙醇浸泡15 min，無(wú)菌超凈臺(tái)吹干備用。用10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg，ip)大鼠，然后于左后肢備皮，碘酒及酒精局部消毒。將上述裝置中的明膠海綿包裹在分離好的左側(cè)坐骨神經(jīng)上，通過(guò)PE-10管注入200 μL、100 ng/L的 rrTNF 或0.1%BSA。每天1次，共2 d。

3.2 鞘內(nèi)置管與給藥 TNP-ATP和PPADS用生理鹽水分別溶解至23.7 g/L和30 g/L。大鼠消毒，暴露出L6棘突，用1 mL注射器針頭在L5/L6椎間隙刺入蛛網(wǎng)膜下腔，可看到大鼠甩尾，同時(shí)左手將PE-10管用眼科彎鑷持住沿小口進(jìn)入，向前1 cm即可，此時(shí)可看到清亮腦脊液出來(lái)，固定好PE-10管，縫皮，單籠飼養(yǎng)，等大鼠恢復(fù)一段時(shí)間后再通過(guò)PE-10管注入TNP-ATP或PPADS，每次注射10 μL，連續(xù)注射7 d。前2次給予TNP-ATP或PPADS 10 min后再在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF。

3.3 Westen blot實(shí)驗(yàn) 如我們以前文章［9］所述的方法進(jìn)行，首先分離大鼠L4～L6段脊髓，取給藥同側(cè)脊髓背角，分別按重量加入 Tris裂解緩沖液(0.1%SDS，1%NP-40，1 μmol/L OA，0.02%NaN3，10 mmol/L EGTA，0.2 g/L trypsin inhibitor，1 mmol/L NaVO4，1 mmol/L PMSF，protease inhibitor cocktail tablet)，低溫勻漿，超聲破碎。12 000 r/min低溫離心，取上清液。用Micro-BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品加入6 μL上樣緩沖液，混勻后，沸水煮沸10 min。SDS-PAGE分離蛋白，200 V電泳45 min，后100 V、1 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉 1 h，孵育抗 P2X4受體抗體(1∶500，Alomone)或抗TNF-α 抗體(1∶1 000，Abcam)4℃ 過(guò)夜 ，漂洗3次，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色1～3 min，曝光。計(jì)算機(jī)行灰度掃描，定量分析。

3.4 免疫熒光染色 坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后7 d的大鼠，首先灌注300 mL生理鹽水，然后灌注350 mL冷的含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)。取出 L4～L5脊髓，后固定3 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中4℃ 2 d。在冰凍切片機(jī)(Leica CM3050S)進(jìn)行脊髓橫切面的切片(25 μm)，如文獻(xiàn)［6］所述的方法進(jìn)行熒光染色。簡(jiǎn)言之，切片用含3%驢血清0.3%Triton室溫封閉1 h，孵育抗P2X4受體抗體(1∶100)、神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)抗體(1∶500;Chemicon)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(1∶500;Chemicon)和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 Iba-1(1∶500;Serotec)的混合液4℃過(guò)夜，然后加入FITC和Cy3標(biāo)記的2種II抗(1∶200;Jackson)，室溫下反應(yīng)1 h。染色的切片于Olympus IX71(Olympus)熒光顯微鏡下觀察并用CCD相機(jī)拍照。

3.5 50%機(jī)械刺激撤足閾值的測(cè)定 為了使大鼠熟悉并適應(yīng)測(cè)試環(huán)境，消除大鼠心理因素對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，將大鼠放置于測(cè)試的有機(jī)玻璃箱內(nèi)約10 min，待大鼠安靜后，采用 Up-Down 方法［1］，選 8 根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增方式的 von Frey hair(0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51 和 15.14 g)分別對(duì)大鼠后肢左右腳足心部進(jìn)行機(jī)械性刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為6～8 s。以2.04 g刺激強(qiáng)度為初始刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陰性，則選用刺激強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增的相鄰von Frey hair繼續(xù)刺激;若撤足反應(yīng)為陽(yáng)性，則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)用SPSS 17.0處理。所有的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。行為學(xué)測(cè)試結(jié)果采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析，同一組大鼠不同測(cè)試時(shí)點(diǎn)的數(shù)據(jù)先用Friedman ANOVA檢驗(yàn)差異，然后再用兩組相關(guān)數(shù)據(jù)的秩和檢驗(yàn)分析。Western blot結(jié)果用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的凈吸光度值，使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF-α后同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體的表達(dá)水平明顯升高

已有證據(jù)表明P2X4受體是神經(jīng)病理性疼痛的一個(gè)關(guān)鍵分子［3-5］，因此我們檢測(cè)坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后脊髓背角P2X4受體的表達(dá)是否增加。結(jié)果顯示，與naive組或vehicle組相比，坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后3 d、7 d和14 d同側(cè)脊髓背角P2X4受體的表達(dá)明顯上調(diào)，見(jiàn)圖1。為了確定激活的P2X4受體在哪種細(xì)胞表達(dá)，在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后7 d進(jìn)行免疫熒光雙染，發(fā)現(xiàn)P2X4受體僅與Iba-1存在共染，與GFAP或NeuN不存在共染，表明坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元的P2X4受體的表達(dá)水平明顯升高，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The expression of P2X4receptor in the spinal dorsal horn significantly increased after peri-sciatic administration of rrTNF(PST).Mean±SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs naive group.圖1 坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后脊髓背角P2X4受體的表達(dá)水平明顯升高

Figure 2.P2X4receptor was co-localized only with microglia in spinal dorsal horn after peri-sciatic administration of rrTNF.圖2 坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后P2X4受體在脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)

2 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏

為了評(píng)價(jià)P2X4受體在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏中的作用，在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF的大鼠前鞘內(nèi)應(yīng)用給予2種P2X受體拮抗劑，一種是 TNP-ATP，P2X 受體1、2、3、4 亞型的拮抗劑;另一種是 PPADS，P2X 受體1、2、3、5、7 亞型的拮抗劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNP-ATP阻斷坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏，而PPADS則不能。這表明P2X4受體可能在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏中起重要作用，見(jiàn)圖3。

3 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起的脊髓背角TNF-α的上調(diào)

以前的研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF可引起脊髓背角TNF-α的上調(diào)［1］，那P2X4受體是否在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的脊髓背角TNF-α的上調(diào)中發(fā)揮作用，因此我們也觀察了在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF的大鼠前鞘內(nèi)應(yīng)用TNP-ATP和PPADS后脊髓背角TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(鞘內(nèi)應(yīng)用NS)相比，TNP-ATP明顯抑制脊髓背角TNF-α的上調(diào)，而PPADS則不能。這表明P2X4受體可能通過(guò)上調(diào)脊髓背角的TNF-α在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起的機(jī)械痛敏中發(fā)揮重要作用，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The effects of P2X4receptor on mechanical allodynia induced by peri-sciatic administration of rrTNF.The intrathecal injection of TNP-ATP completely blocked the mechanical allodynia throughout the course of the tests，whereas the intrathecal injection of PPADS in the same way did not.Upward and downward arrows indicate the time of rrTNF and drug administration，respectively.Mean±SEM.n=8.*P＜0.05 vs baseline(－1 d).圖3 P2X4受體在坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF引起的機(jī)械痛敏中的作用

Figure 4.Blockage of P2X4receptor inhibited the upregulation of TNF-α induced by peri-sciatic administration of rrTNF in the spinal dorsal horn.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS.圖4 阻斷P2X4受體抑制坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的脊髓背角TNF-α的上調(diào)

討 論

目前的研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后同側(cè)脊髓背角P2X4受體的表達(dá)水平明顯升高，P2X4受體僅位于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞。鞘內(nèi)應(yīng)用TNP-ATP可抑制坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF誘導(dǎo)的機(jī)械痛敏和脊髓背角TNF-α的上調(diào)。這些結(jié)果表明坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后，通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞的P2X4受體使脊髓背角的TNF-α表達(dá)增加，這樣形成一個(gè)正反饋，引起大鼠后爪長(zhǎng)達(dá)20 d的機(jī)械性痛閾下降和熱痛反應(yīng)增強(qiáng)。

Tsuda等［3］發(fā)現(xiàn):神經(jīng)損傷后1 d，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的P2X4受體上調(diào);鞘內(nèi)應(yīng)用P2X4受體的反義寡核苷酸抑制受體的上調(diào)和神經(jīng)損傷后的觸誘發(fā)痛。我們以前的結(jié)果顯示，ATP通過(guò)上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體的表達(dá)誘導(dǎo)脊髓背角的LTP［6］。目前的研究也取得類(lèi)似結(jié)果，這表明神經(jīng)損傷或坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后，胞外ATP可能釋放增加，作用于P2X4受體，從而增強(qiáng)脊髓背角的突觸傳遞，產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。

TNF-α作為神經(jīng)損傷和炎癥過(guò)程中最重要和最早釋放的致炎細(xì)胞因子，在神經(jīng)纖維Wallerian變性和神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生過(guò)程發(fā)揮重要作用［10］。在多種神經(jīng)損傷引起病理性疼痛的動(dòng)物模型中，TNF-α在脊髓背角和背根節(jié)的表達(dá)明顯升高，抑制TNF-α的合成或拮抗其受體可減輕神經(jīng)病理性疼痛［2］。足底注射、皮下注射、坐骨神經(jīng)內(nèi)注射TNF-α均能夠誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀［11-13］。我們目前的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF可誘導(dǎo)大鼠機(jī)械痛敏和脊髓背角TNF-α的上調(diào)，P2X4受體參與此過(guò)程。Li等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)的表達(dá)可被 TNP-ATP 所抑制，這表明P2X4受體可誘導(dǎo)致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。我們最近的研究［15］發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF可激活脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的SFKs和p38，并通過(guò)SFKs/p38信號(hào)通路引起脊髓背角TNF-α的上調(diào)。因此，我們推測(cè)坐骨神經(jīng)周?chē)o予rrTNF后，可能引起脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體的表達(dá)增加，P2X4受體通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞SFKs/p38信號(hào)通路使脊髓背角TNF-α的表達(dá)增加誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生機(jī)械痛敏。

［1］ Wei XH，Zang Y，Wu CY，et al.Peri-sciatic administration of recombinant rat TNF-α induces mechanical allodynia via upregulation of TNF-α in dorsal root ganglia and in spinal dorsal horn:the role of NF-kappa B pathway［J］.Exp Neurol，2007，205(2):471-484.

［2］ Leung L，Cahill CM.TNF-α and neuropathic pain:a review［J］.J Neuroinflammation，2010，7:27.

［3］ Tsuda M，Shigemoto-Mogami Y，Koizumi S，et al.P2X4receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury［J］.Nature，2003，424(6950):778-783.

［4］ Tsuda M，Kuboyama K，Inoue T，et al.Behavioral phenotypes of mice lacking purinergic P2X4receptors in acute and chronic pain assays［J］.Mol Pain，2009，5:28.

［5］ Nagata K，Imai T，Yamashita T，et al.Antidepressants inhibit P2X4receptor function:a possible involvement in neuropathic pain relief［J］.Mol Pain，2009，5:20.

［6］ Horvath R，Romero-Sandoval EA，Deleo JA.Inhibition of microglial P2X4receptors attenuates morphine tolerance，Iba1，GFAP and μ opioid receptor protein expression while enhancing perivascular microglial ED2［J］.Pain，2010，150(3):401-413.

［7］ Gong QJ，Li YY，Xin WJ，et al.ATP induces LTP of C-fiber evoked field potentials in spinal dorsal horn:the roles of P2X4receptors and p38 MAPK in microglia［J］.Glia，2009，57(6):583-591.

［8］ Sandkühler J.Understanding LTP in pain pathways［J］.Mol Pain，2007，3:9.

［9］ Gong QJ，Chen JS，Huang QD，et al.Effects of SFKs in microglia on ATP-induced long-term potentiation in the spinal dorsal horn ［J］.Chin J Pathophysiol，2011，27(6):1563-1568.

［10］ 鄭亞國(guó)，馬正良.腫瘤壞死因子-α和神經(jīng)病理性疼痛［J］.國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2011，32(1):101-106.

［11］ Junger H，Sorkin LS.Nociceptive and inflammatory effects of subcutaneous TNFα［J］.Pain，2000，85(1-2):145-151.

［12］ Sorkin LS，Xiao WH，Wagner R，et al.Tumour necrosis factor-alpha induces ectopic activity in nociceptive primary afferent fibres［J］.Neuroscience，1997，81(1):255-262.

［13］ Sorkin LS，Doom CM.Epineurial application of TNF elicits an acute mechanical hyperalgesia in the awake rat［J］.J Peripher Nerv Syst，2000，5(2):96-100.

［14］ Li F，Wang L，Li JW，et al.Hypoxia induced amoeboid microglial cell activation in postnatal rat brain ismediated by ATP receptor P2X4［J］.BMC Neurosci，2011，12:111.

［15］ Li YY，Wei XH，Lu ZH，et al.Src/p38 MAPK pathway in spinal microglia is involved in mechanical allodynia induced by peri-sciatic administration of recombinant rat TNF-α［J］.Brain Res Bull，2013，96:54-61.